Милан Барай

1 Катедра по генно инженерство и биотехнологии, Университет на Дака, Дака-1000, Бангладеш

Назмул Ахсан

1 Катедра по генно инженерство и биотехнологии, Университет на Дака, Дака-1000, Бангладеш

Ниланяна Павел

1 Катедра по генно инженерство и биотехнологии, Университет на Дака, Дака-1000, Бангладеш

Халед Хосейн

2 Катедра по биохимия и молекулярна биология, Университет Раджшахи, Раджшахи-6205, Бангладеш

Мохамад Абдур Рашид

3 Департамент по фармацевтична химия, Университет на Дака, Дака-1000, Бангладеш

Масаши Като

4 Катедра по трудово и екологично здраве, Медицински факултет на Университета Нагоя, Нагоя, Япония

Нобутака Огами

4 Катедра по трудово и екологично здраве, Медицински факултет на Университета Нагоя, Нагоя, Япония

Анурул Азим Аханд

1 Катедра по генно инженерство и биотехнологии, Университет на Дака, Дака-1000, Бангладеш

Катедра по генно инженерство и биотехнологии, Университет на Дака, Дака-1000, Бангладеш

Тел: 880-2-9661920 вътр. 7818, факс: + 880-2-9667222, имейл: [email protected]

РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Арсенът, отровен тежък метал, е устойчив в околната среда и има потенциал за широк спектър от вредни последици за здравето. Милиони хора в Бангладеш и много други страни са изложени на повишени нива на арсен чрез пиене на замърсени подпочвени води. 1,2) Излагането на арсен по този начин създаде сериозна загриженост за общественото здраве в световен мащаб. Ефектът от това отравяне с тежки метали е очевиден или за кратко време, или след продължително излагане, в зависимост от дозата и пътя на влизането му, защитния механизъм на тялото и хранителния статус на индивида. Дългосрочната експозиция на арсен причинява широк спектър от неблагоприятни ефекти върху здравето, включително загуба на тегло, кожни лезии, рак, сърдечно-съдови заболявания (ССЗ), диабет, чернодробни нарушения, имунотоксичност и др. 3-7) Повечето от съединенията с арсен са известни да бъде разтворим във вода до известна степен, като по този начин лесно се транспортира през кръвта до различни органи на тялото. Въпреки че част от арсена, който постъпва в тялото, се екскретира, обаче се съобщава, че значителна част се абсорбира от различни тъкани/органи, включително коса, нокти, черен дроб, бъбреци, сърце, бял дроб и далак, причинявайки неблагоприятни физиологични ефекти. 8-10)

Сред няколко хипотези, предложени за разбиране на механизма на токсичност с арсен, участието на индуцирания от арсен оксидативен стрес се счита за най-видно. Индуцираният от арсен оксидативен стрес се дължи главно на способността му да генерира реактивни кислородни форми (ROS) и да взаимодейства със сулфхидрилни групи протеини/ензими. 11-13) Различни проучвания демонстрират, че този оксидативен стрес е способен да наруши множество клетъчни сигнални пътища, които могат да играят видна роля в проявата на болестта, медиирана от арсен. 14,15) Въпреки признаването на глобалната заплаха за общественото здраве от токсичност с арсен; неговото ефективно, надеждно и безопасно лечение все още остава предимно неизвестно. Като се има предвид наличието на връзка между токсичността на арсен и оксидативния стрес, изследователите очакват да използват антиоксидантните свойства на различни растителни екстракти за борба с отравяне с арсен.

Последните проучвания демонстрират потенциална роля на антиоксидантите в превенцията и/или управлението на токсичността на арсен. 16,17) Следователно, природните съединения на растителна основа и техните активни съставки с висок антиоксидантен потенциал са получили голямо внимание поради способността им да противодействат на токсичните ефекти на арсена. 18,19) Доказано е, че естествените антиоксиданти, присъстващи в екстракта от чай, предпазват от индуцираната от арсен токсичност. 20,21) Наскоро съобщихме, че индуцираната от арсен загуба на телесно тегло на мишките и разширяването на различни органи са предотвратени чрез хранителни добавки с екстракт от листа на Phyllanthus emblica. 9) Следователно търсенето на антиоксиданти в плодовете, зеленчуците и лечебните растения за подобряване на токсичните ефекти на тежките метали привлича голямо внимание по целия свят.

Syzygium cumini Linn. (семейство Myrtaceae), добре познато овощно растение, е широко разпространено в тропическите и субтропичните региони, включително Бангладеш. S. cumini е много ценен за това, че притежава биоактивни съединения като флавоноиди, гликозиди, танини, антоцианини и аскорбинова киселина; всички те имат отлични антиоксидантни свойства. 22,23) В този контекст досега са описани множество терапевтични приложения на S. cumini; сред тях са антидиабетни, противовъзпалителни, антидиарейни, противоракови и антимикробни дейности. 24-27) В настоящото разследване екстрактът от листата на S. cumini беше оценен за неговата превантивна активност срещу медиирани от арсен неблагоприятни ефекти при експериментални мишки.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Растителни материали

Листата на S. cumini са събрани от овощни градини в кампуса на Curzon Hall, Университет на Дака, Бангладеш. Растението беше идентифицирано и удостоверено, а образец на ваучер (присъединителен номер 34742) на растението беше депозиран в Националния хербариум в Бангладеш.

Приготвяне на екстракти от листа на S. cumini (SLE)

SLE се получава, както е описано по-горе. 25) Накратко, листата се почистват и изсушават на въздух при стайна температура, като се пазят от пряка слънчева светлина в продължение на 7–10 дни, последвано от смилане до едър прах. Така полученият листен прах (250,0 g) се накисва в 1 L етанол (95%) в колба и се държи за екстракция при стайна температура в продължение на 1 седмица. След това екстрактът се филтрира с помощта на филтърна хартия Whatman (№ 11) за събиране на филтрата. Остатъкът отново се накисва в етанол, за да се получи допълнителна екстракция. След това всички събрани филтрати се концентрират с помощта на вакуумен ротационен изпарител при намалена температура и налягане. Полученото по този начин смолисто вещество се подлага на сушене при стайна температура, за да се получи прахообразната форма. Прахообразният екстракт се претегля и съхранява при 4 ° C за по-нататъшна работа. От 250,0 g сух листен прах накрая се получават 35,5 g (14,2%) от екстракта. Екстрактът се смесва с фураж за мишки, закупен от Международния център за изследване на диарейната болест, Бангладеш (icddr, b).

Поддръжка на животни

Швейцарски мишки албиноси (мъжки, на възраст 6 седмици) са закупени от icddr, b. Мишките бяха избрани на случаен принцип и настанени в пластмасови клетки с постелки от дървесни кочани (6 мишки/клетка). След една седмица на аклимация, мишките бяха разделени на четири групи, а именно контрол, арсен (As), As + SLE и SLE. „Контролните“ мишки бяха снабдени с милиQ вода, използвайки бутилки за хранене и нормална храна за мишки. На мишките „As group“ се дава нормален фураж и натриев арсенит (NaAsO2), съдържащ вода (приготвена в милиQ вода, 10 μg/g телесно тегло/ден), докато мишките „As + SLE“ получават SLE (50 μg/g телесно тегло/ден), съдържащи фураж и As-съдържаща вода. „SLE групата“ е снабдена със SLE, съдържаща фураж и милиQ вода. Тези различни групи мишки се поддържат в продължение на 12 седмици. Всички тези процедури и експерименти с мишки са предприети в съответствие с етичните въпроси, поставени от Факултета по биологични науки, Университета на Дака, Бангладеш.

Измерване на телесното и органното тегло на мишки

Всяка мишка от всички групи се претегля на всеки две седмици с помощта на аналитичен вез и се записва съответно. След 12 седмици поддръжка, мишките бяха умъртвени чрез цервикална дислокация и коремът беше изложен хирургически чрез вентрален разрез. Бъбреците, черният дроб и далакът бяха отстранени внимателно, почистени от всички мазнини и съединителна тъкан и претеглени. След това се изчислява средното съотношение орган/телесно тегло (mg/g).

Вземане на кръв и анализ на различни серумни параметри

Хирургическо острие (размер 11) беше притиснато рязко между ухото и окото на мишките. Кръв излиза като капки и се събира в епруветки. След това серумът се отделя от събраната кръв и се поддържа при –80 ° C, докато се направят анализите за различни параметри. Измерват се нивата на серумна глюкоза и пикочна киселина и се определят алкална фосфатаза (ALP), аланин аминотрансфераза (ALT) и лактат дехидрогеназа (LDH), като се използва търговски наличен комплект за анализ, съгласно протокола на производителя (Human Diagnostic, Германия; DiaSys Diagnostic Systems, Турция; и Biosystems SA, Испания). Всички серумни проби бяха анализирани в два екземпляра и след това бяха използвани средни стойности.

Измерване на отлагането на арсен в тъканни проби на мишки, изложени на As

Нивата на арсен в тъканните проби на изложени на As мишки се измерват по метода, описан по-горе. 28) Накратко, проби от черен дроб и далак са взети в 15 ml полипропиленова епруветка в присъствието на 3 ml азотна киселина (61%). Епруветките се затварят правилно и се инкубират при 80 ° С в продължение на 48 часа, последвано от охлаждане за 1 час до стайна температура. След охлаждане към всяка епруветка се добавят 3 ml водороден прекис (30%), последвано от инкубация при 80 ° С в продължение на 3 часа. След подходящо разреждане на усвоените материали с ултрачиста вода, нивата на арсен в пробите се определят чрез индуктивно свързан плазмно-масспектрометър (ICP-MS; 7500cx, Agilent Technologies, Inc.) с реакционна клетка за отсъствие на ArCl йон намеса.

Статистически анализ

Статистическите анализи за това проучване бяха извършени с помощта на софтуер на Статистически пакети за социални науки (SPSS версия 17.0, SPSS Inc., Чикаго, Илинойс). Данните бяха показани като средна стойност ± SD. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA, последван от множество тестове за сравнение на Bonferroni. Стойност на p Фиг. 1. След 12 седмици средното телесно тегло на контролната група As, As + SLE и SLE стана 32,25 ± 1,5, 19,81 ± 1,3, 25,57 ± 0,73 и 31,78 ± 0,65 g, съответно. Беше забелязано, че контролните мишки натрупват тегло постепенно с времето; обаче нормалното наддаване на телесно тегло при изложени на As мишки е нарушено. Увеличаването на телесното тегло при изложени на As мишки е значително намалено в сравнение с контрола на 4, 8 и 12 седмици (pa Значително различно (pb Значително различно (p Таблица 1. При контролните мишки, средно ± SD съотношения между тегло на органи към тяло за далака), бъбреците и черния дроб бяха съответно 3,6 ± 0,32, 12,5 ± 1,29 и 42,2 ± 4,76. Съотношенията между органи и тела за далак, бъбреци и черен дроб на мишки, изложени на As, бяха значително увеличени (p Таблица 1). Тези резултати показват, че СЛЕ може да е изиграл важна роля за намаляване на медиираните от арсен токсични ефекти върху засегнатите органи.

маса 1

Съотношения между теглото на тялото и тялото и на четирите групи мишки след 12 седмици

Орган тегло/тегло тегло (mg/g) ControlAsAs + SLESLE
Далак3,6 ± 0,324,9 ± 0,24 а 3,9 ± 0,24 b 3,7 ± 0,43
Бъбреци12,5 ± 1,2919,1 ± 3,39 a 14,5 ± 1,28 b 12,8 ± 1,49
Черен дроб42,2 ± 4,7654,2 ± 2,97 a 46,1 ± 3,37 b 41,5 ± 3,35

Стойности, показани като средни стойности ± SD (n = 6 на група).

a Значително различен (pb Значително различен (p Фиг. 2А. Тези увеличения на ензимните активности са статистически значими (p Фиг. 2Б). Този резултат показва възможно медиирано от арсен увреждане на сърцето и други тъкани, което може да е причинило повишаване на серумния LDH Отново забелязахме, че това серумно повишаване на LDH е частично блокирано при добавяне на SLE.

арсен

SLE частично спасява медиирано от арсен повишаване на серумните ензими.

Отлагане на арсен (mg/Kg телесно тегло) в черния дроб и далака на мишки, изложени на As.

Данните са показани като средна стойност ± SD (n = 3 на група). a Значително различен (p 29, 30) Тъй като повишаването на LDH вече се наблюдава в това проучване, ние след това изследвахме дали излагането на арсен също е свързано с повишено ниво на пикочна киселина. Както е показано на фиг. 4, серумната пикочна киселина в групата, изложена на As (4.15 ± 0.23 mg/dl), се увеличава в сравнение с контролата (3.44 ± 0.29 mg/dl). Въпреки че добавянето на SLE частично блокира повишаването на този ензим, разликата обаче не е статистически значима (p> 0,05), когато групата, изложена на As, е сравнена с As + SLE групата. Известно е, че арсенът предизвиква захарен диабет, 6,31,32), докато е доказано, че захарният диабет е свързан с нивото на пикочна киселина. 33-35) Следователно тествахме дали изложени на As мишки придружават повишено ниво на серумна глюкоза. Наблюдавахме, че експозицията на арсен значително (р 0,05), индуцираното от As повишаване на нивото на глюкозата.

SLE частично спасява арсен-медиирано повишаване на серумната пикочна киселина и глюкоза

Въпреки че почти всички органи са засегнати от излагане на арсен, черният дроб, бъбреците и далака се считат за най-податливи на токсичните ефекти. 44-46) В нашето проучване се наблюдава значително увеличение на теглото на черния дроб, бъбреците и далака при изложени на As мишки, демонстрирано чрез повишено съотношение орган/телесно тегло (Таблица 1). Нашите резултати са в съответствие с предишни доклади, които показват връзка между излагането на арсен и хепатомегалия, спленомегалия или уголемяване на бъбреците. 7,9,44) Едновременното лечение със СЛЕ заедно с арсен може значително да възстанови теглото на органите до почти нормално състояние, което е показател за терапевтичния потенциал на СЛЕ срещу токсичността на арсен.

Счита се, че клетъчното и тъканно натрупване на арсен е основна грижа поради постоянния му потенциал за увреждане. Известно е, че арсенът се натрупва в различни органи, включително черния дроб, бъбреците, сърцето, белите дробове, мускулите и далака при поглъщане от хора и животни. 8,9,50) Значително високи нива на натрупване на арсен също са наблюдавани в това проучване в тестваните органи от групата, изложена на As (Фиг. 3). Въпреки че SLE беше твърдо в състояние да предотврати намаляване на наддаването на телесно тегло и увеличаване на теглото на органи при мишки, изложени на As (фиг. 1 и таблица 1), способността му да намалява отлагането на арсен в органите обаче не беше значителна.

Натрупват се доказателства в полза на връзката между излагането на арсен и индуцирането на диабет при хора и животни. 6,31,32) Нашето проучване показва значителна разлика в нивото на кръвната глюкоза между контролни и третирани с As мишки (фиг. 4), подкрепящи горното схващане. Повишаването на нивото на глюкоза може да обясни цитотоксичния ефект на арсена върху β-клетките на панкреаса. 51) В допълнение към повишаването на нивото на глюкозата, третираните мишки също придружават повишаване на нивото на пикочна киселина. Нашите резултати действат в съответствие с предишните доклади, демонстриращи ролята на пикочната киселина в проявата на диабет 33-35), но връзката между пикочната киселина и хипергликемията не винаги е последователна. Много проучвания показват положителна връзка между нивата на серумна пикочна киселина и глюкоза, докато други предполагат обратна връзка. 52,53) Въпреки че SLE значително блокира предизвиканите от арсен повишения на серумната активност на ALP, ALT и LDH, но не може да намали значително нивата на серумната пикочна киселина и глюкозата.

В заключение, настоящото проучване демонстрира значителен ефект на СЛЕ срещу индуцирано от арсен намаляване на наддаването на телесно тегло, разширяване на органите и увеличаване на различни серумни параметри. Един от основните механизми зад токсичността на арсен се дължи на оксидативния стрес. Във връзка с тази гледна точка, SLE може да покаже защита срещу индуцирана от арсен токсичност чрез способността си да противодейства на оксидативния стрес. Наличието на редица потенциални антиоксиданти в тестовите екстракти 22,23,25,54) вероятно е допринесло за цялостната защита срещу вредните ефекти. Въпреки големия потенциал на SLE за подобряване на неблагоприятните ефекти, причинени от арсен, точната роля на съставките на SLE в процеса на подобряване все още не се разбира ясно. Следователно са необходими допълнителни изследвания за физиологичните, клетъчните и молекулярните механизми на съставките, присъстващи в екстракта. Това може да ни накара да разработим терапевтично лекарство на базата на SLE в бъдеще за намеса на усложненията, дължащи се на излагане на арсен при хора.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подпомогната отчасти от безвъзмездна помощ от Университетската комисия за стипендии (UGC) в Бангладеш. Благодарим на Shoko Ohnuma за ICP-MS анализ на тъканните проби.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Всички автори декларират, че нямат действителни или потенциални конфликти на интереси.