Резюме

Въведение

Обикновено се смята, че приемането на програми за обогатяване на храни и добавки на фолиева киселина е довело до значителни ползи за общественото здраве, намалявайки честотата на дефектите на нервната тръба с до 48% в някои страни (11). По-нови данни, по-специално от американските национални проучвания за здравни и хранителни изследвания, предполагат обаче, че тези предимства не са били реализирани универсално за социално-икономически и етнически групи в САЩ (12) и че конкретното насочване към високорисковите групи и групите в неравностойно положение би генерират допълнително въздействие. Извън САЩ дефицитът на витамин В9 и В12 по време на бременност остава важен проблем за общественото здраве в страните с ниски доходи (13) и дори в някои развити страни като Япония (14). По-специално в бразилските кохорти по време на бременност, жените с дефицит на витамин В12 показват значително намалени серумни нива на SAM метионовия донор и метионин, но концентрациите на SAH са значително повишени (15).

s-аденозилхомоцистеин

Освен това този дефицит на витамини при майките изглежда се поддържа между поколенията, което води до подобен дефицит при новороденото. Тези открития предполагат, че нарушаването на едновъглеродния цикъл в резултат на недостиг на витамин при майките може да доведе до промени в клетъчното метилиране при майката и потомството. Освен това те предполагат физиологична връзка между дефицита на витамини и последващите модели на адипогенеза, процес, за който е известно, че е значително повлиян от епигенетичните механизми (16,17) и/или функцията на адипоцитите.

Адипогенезата се задвижва от програма за генна транскрипция, която подкрепя превръщането на недиференцирани фибробластични преадипоцити в сферични богати на липиди зрели функциониращи адипоцити. Зрелите адипоцити придобиват инсулинова чувствителност, експресират GLUT4, реагиращ на инсулина, за да медиират усвояването на глюкозата (18, 19) и експресират ензими, участващи в метаболизма на триацилглицерола, за да придадат липогенни и липолитични функции (18). Гените, които кодират ензими, участващи в метаболизма на адипоцитната глюкоза и липидите, се регулират по силно координиран начин от най-малко две семейства транскрипционни фактори, CAAT енхансер-свързващи протеини (CEBPs) и активирани от пероксизома пролифератор рецептори (PPARs) (18). По-специално, CEBPα е замесен в поддържането на фенотипа на адипоцитите, както и в насърчаването на чувствителния към инсулин транспорт на глюкозата (19).

За да установим молекулярна връзка между майчините дефицити на фолат и кобаламин с диференциацията и функцията на адипоцитите, използвахме 3T3-L1 клетъчна линия, добре характеризирана in vitro моделна система за адипогенеза, за да изследваме последиците от излагането на супрафизиологични нива на SAH, имитирайки повишените серумни нива, наблюдавани като последица от недостиг на витамини. Интересното е, че въпреки че не сме променили скоростта на диференциация на адипоцитите, излагането на SAH доведе до променена функционалност, като получените зрели адипоцити проявяват променено изхвърляне на глюкоза и липолиза. Освен това определихме някои от ключовите генни регулатори на този променен фенотип и установихме ролята на епигенетичните механизми в неговата проява.

Изследователски дизайн и методи

Материали и антитела

Всички химикали са закупени от Sigma-Aldrich, освен ако не е посочено друго. Реагентите за клетъчна култура са закупени от Gibco-BRL, Invitrogen. Закупихме 2-дезокси-d - [1- 3Н] глюкоза (37 MBq, 8 Ci/mmol) от PerkinElmer, Waltham, MA.

3T3-L1 клетъчна култура и SAH лечение

Миши 3T3-L1 преадипоцити (American Type Culture Collection; http://www.atcc.org) бяха култивирани и индуцирани да се диференцират с помощта на хормонални коктейли, както беше описано по-рано (20). За всички експерименти преадипоцитите са засяти при 2500 клетки/cm2. Лечението с SAH при посочените дози започва 24 часа след засяването и се поддържа през цялото време на диференциация. За анализи са използвани адипоцити 7–8 дни след индуциране на диференциация. За количествени RT-PCR (RT-qPCR) и хроматинови имунопреципитационни (ChIP) анализи, клетките се събират 5 дни след диференциацията.

Анализ на транспорта на 2-дезокси-d - [1- 3 H] глюкоза

Анализът се извършва, както е описано по-рано (20). Клетките бяха стимулирани със 100 nmol/L инсулин в продължение на 20 минути при 37 ° C преди започване на анализа за транспортиране на глюкоза.

Нил Червен анализ

Анализът е извършен, както е описано по-рано с малки модификации (21). Диференцираните адипоцити в 96-ямкови плаки се фиксират в 4% параформалдехид (рН 7.4) в продължение на 10 минути и се измиват веднъж с PBS, последвано от инкубация с 10 μg/mL Nile red и 1 μg/mL DAPI за 15 минути. Относителната интензивност на флуоресценция за червен цвят на Нил се използва като индикатор за натрупване на липиди (сурогат за диференциация) и се измерва с четец на плочи BioTek Synergy 2, използвайки филтърни комплекти 485/528 и 360/460. Броят на клетките се нормализира, като се използва DAPI флуоресценция.

Анализ на липолиза

Диференцираните адипоцити се изплакват с PBS два пъти и се инкубират в модифицираната от Dulbecco среда на Eagle’s/2% BSA за 1 h при 37 ° C в присъствието на 10 µmol/L изопротеренол или носител. Средата се събира и освобождаването на свободен глицерол се измерва, като се използва свободен глицеринов реагент, съгласно инструкциите на производителя. Резултатите бяха нормализирани до общото вътреклетъчно съдържание на протеин.

Имуноблотинг

За целите клетъчни лизати, адипоцитите се събират в лизисен буфер, съдържащ 150 mmol/L NaCl, 0.5% Nonidet P-40 и 20 mmol/L Tris (pH 7.4). Концентрациите на клетъчни протеини се определят, като се използва бицинхонинов анализ съгласно инструкциите на производителя (Pierce). Протеините (5–10 µg) бяха разделени върху SDS-PAGE гел и прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана (Bio-Rad). Антителата в 1% обезмаслено мляко бяха използвани при следните разреждания: α-H3K4me3, 1: 1 500; α-H3K27me3, 1: 4000; α-H3K9me3, 1: 1000; α-H3K9Ac, 1: 5000; и α-пан H3-CT, 1: 20 000 (Millipore). Резултатите бяха визуализирани с конюгирано с пероксидаза от хрян козе анти-заешко вторично антитяло и засилена хемилуминесценция (Pierce). Интензитетите на имуноблотните ленти бяха количествено определени с помощта на софтуера ImageJ 1.45 (Национален здравен институт).

Детекция на SAM, SAH и Hcy чрез течна хроматография, свързана с тандемна масова спектрометрия

Предишни доклади показват важността на стабилизирането на SAM чрез подкисляване (22,23). Следователно, ние подготвихме клетъчните екстракти и измерихме метаболитите, използвайки комбинираните методи от предишни доклади, с модификации (22–24). Накратко, клетките, диференцирани в присъствието или отсъствието на SAH в 10-сантиметрови съдове, бяха изплакнати два пъти в PBS и лизирани в пет обема ледено студен подкислен ацетонитрил (90% ацетонитрил, съдържащ 0,1% мравчена киселина), след което 5 μL лизат беше замразени за определяне на вътреклетъчен протеин. Останалият лизат се центрофугира при 12 000 g в продължение на 5 минути за избистряне на екстракта и супернатантата се съхранява при -80 ° С за откриване на метаболит. Пробите бяха допълнително разредени преди анализ на течна хроматография в тандем с масова спектрометрия (LC-MS/MS), който беше извършен с помощта на колона Diamond Hydride HILIC (2.1 × 100 mm, 4 μm; MicroSolv Technology Corporation). Детекторът беше Q-Exactive Orbitrap, работещ в целевия режим MS/MS и следователно позволяващ MS/MS с висока разделителна способност, осигуряващ по-голяма специфичност в сравнение с традиционните квадруполни MS/MS протоколи (23,24).

RT-qPCR и ChIP

Общата РНК се екстрахира, използвайки метода Trizol (Invitrogen). РНК се инкубира с DNAseI (Invitrogen) и 1 μg RNA се транскрибира обратно с помощта на Superscript III съгласно протокола на производителя (Invitrogen). CDNA беше подложена на SYBR Green qPCR (Roche), използвайки генно специфични праймери. Експресията на РНК се нормализира до циклофилин А (Ppia). Резултатите бяха изчислени като съотношението цел-Ppia, използвайки софтуера LightCycler 480 (Roche). ChIP се извършва, както е описано по-рано (25). Последователностите за праймери RT-qPCR и ChIP са изброени в Таблица 1.

Последователности на грундове за RT-qPCR и ChIP-qPCR

Анализ на ДНК метилиране

Клетките се събират в лизисен буфер, съдържащ 150 mmol/L NaCl, 1% SDS и 20 mmol/L Tris (рН 8.0). Клетъчните лизати се инкубират с 0,2 mg/ml протеиназа К при 65 ° С за една нощ. РНКаза А при 0.2 ug/mL се добавя за последния 1 h инкубация. Геномната ДНК се екстрахира, използвайки фенол-хлороформния метод. ДНК метилирането се измерва, като се използва системата Sequenom Mass Array (Sequenom, Inc.). Анализът на секвен и дизайнът на праймера са извършени съгласно протокола на производителя. Комплектът за метилиране на EZ-DNA (Zymed Laboratories) се използва за превръщане на бисулфит на 1 ug ДНК. PCR амплификация на конвертирана от бисулфит ДНК се извършва, както следва: денатурация на 94 ° C за 20 s, отгряване от 58 ° C за 30 s и удължаване на 72 ° C за 1 min, за 45 цикъла и окончателно удължаване от 72 ° C за 3 мин. Последователностите на праймерите са изброени в Таблица 2. MS анализът се извършва с помощта на софтуера EpiTyper 1.0 (Sequenom, Inc.). За фрагменти, съдържащи единично място на CpG, метилирането на ДНК се изчислява чрез съотношението на метилирани към неметилирани фрагменти. За продукти на разцепване, съдържащи множество CpG, EpiTyper отчита стойностите на метилиране като среднопретеглени средни фрагменти.

Последователности на грундове за Sequenom EpiTyper MassArray

Статистически анализ

SAH уврежда усвояването и липолизата на адипоцитната глюкоза, без да засяга диференциацията. Общият брой клетки (A) и вътреклетъчният протеин (B) са измерени в преадипоцити при 90% сливане (Pre-DF), постконфлуенция в началото на диференциацията (D0) или в адипоцити, диференцирани за 3 дни (D3) или 7 дни (D7 ) при отсъствие или присъствие на SAH. C: Ниво на Dlk1 РНК в преадипоцитите преди началото на диференциацията (D0) и на ден 5 (D5) след индукция на диференциация при отсъствие или присъствие на SAH. D: Зрелите адипоцити са били стимулирани или не с инсулин (100 nmol/L, 20 минути) преди анализи. След това се оценява основното и стимулирано от инсулина усвояване на глюкоза. Адипоцитите с и без лечение със SAH бяха измерени за общ вътреклетъчен липид (Е) или стимулирани с изопротеренол или не (базален) (F). След това бяха събрани среди за измерване на освобождаването на клетъчен глицерол. Статистическа значимост: ^ Относително към базалните клетки без лечение със SAH. # Относно стимулираните с инсулин клетки без лечение с SAH. n.s., без значение. Резултатите са средни ± SEM от три независими експеримента и четири независими експеримента за усвояване на глюкоза.

SAH инхибира селективно подмножество адипогенни гени. Адипоцитите, третирани с посочените SAH дози, се събират 5 дни след диференциацията и РНК се екстрахира, за да се измери експресията на гени, използвайки RT-qPCR. Резултатите са средно съотношение цел-Ppia ± SEM от три независими експеримента.

Като се има предвид, че адипогенната диференциация се регулира епигенетично (16,17), ние изследвахме дали медиираното от SAH инхибиране на експресията на гените е свързано с промени в метилирането на ДНК. След адипогенна диференциация в отсъствие или присъствие на SAH, геномната ДНК се екстрахира, превръща бисулфит и Klf4, Cebpα, Cebpβ и Rxrα геномни области се оценяват за промени в CpG метилирането. Установихме, че метилирането на CpG е непроменено за промоторните области на Klf4 (фиг. 3А) и Cebpβ (фиг. 3В), въпреки медиираната от SAH намалена експресия на тези гени. Поради естеството на последователността около CpG мястото, което представлява интерес, съдържащо повторения, не можахме да измерим метилиране на Cebpα; този ампликон не успя PCR амплификация въпреки многобройните ни опити (данните не са показани). Установихме, че метилирането на Rxrα върху два от пет CpG остатъка в интрон 1, близо до промотора, е относително непроменено в SAH-изложени и неекспонирани адипоцити (chr2: 27,521,169+ и chr2: 27,521,208+; Фиг. 3C). За разлика от това открихме значително 10% увеличение на метилирането на CpG единица, съдържаща два CpG остатъка (chr2: 27,521,057+, chr2: 27,521,049+; P = 0,003) и на единичен CpG остатък при chr2: 27,521,080+ (P = 0,02 ) в адипоцити, изложени на 10 µmol/L и 100 µmol/L SAH в сравнение с адипоцити в отсъствие на SAH.

Излагането на SAH избирателно увеличава метилирането на ДНК върху гена Rxrα. CpG метилиране (CpG-Me) в адипоцити, третирани с 10 µmol/L и 100 µmol/L SAH (или не) бяха измерени за Klf4 (A), Cebpβ (B) и Rxrα (C). Схемите на геномните региони изобразяват измерени CpG места; позиция, номерирана спрямо началото на кодиращата област (+1). ■, екзон. Графики: Геномните координати се отнасят до местоположението на CpG сайтове. Съотношението CpG-към-Me за всеки експеримент (○) е осреднено от три независими експеримента (), а не (■).

След това изследвахме дали модификациите на хистона са променени в адипоцитите, поддържани в постоянно повишена SAH среда. Триметилирането на H3-K27 (H3K27me3) се потиска четирикратно (P = 0,02) в диференцирани адипоцити в сравнение с недиференцирани преадипоцити без лечение с SAH (Фиг. 4А). След излагане на SAH, нивото на H3K27me3 е непроменено в преадипоцитите, но е значително повишено при диференцирани адипоцити четирикратно при 10 µmol/L и 100 µmol/L SAH (P = 0.02) в сравнение с диференцирани адипоцити без лечение с SAH. По подобен начин нивото на H3K4me3 беше потиснато петкратно (P = 0.04) при липса на SAH по време на нормална диференциация. Излагането на SAH поддържа повишено ниво на H3K4me3 след диференциация при 10 µmol/L (P = 0.05) и 100 µmol/L SAH. За разлика от това установихме, че SAH не променя H3K9me3 или ацетилиране на H3-K9 (H3K9Ac) при отсъствие или присъствие на SAH, предполагащо селективен и специфичен ефект на SAH върху профила на модификация, присъстващ върху H3 по време или след диференциация.

Излагането на SAH увеличава модификациите на H3 и заетостта на H3K27me3 при целевите генни промотори в зрелите адипоцити. A: 3T3-L1 преадипоцитите бяха недиференцирани (PreAd) или диференцирани (Ad) при посочените дози SAH. Хистоните бяха извлечени и имуноблотирани (горен панел). Графики: Средна интензивност на лентата ± SEM от три независими експеримента. Статистическа значимост: спрямо диференцирани адипоцити без лечение с SAH, използвайки тест за множествено сравнение на Tukey. Данните бяха нормализирани по интензитет на обхвата на H3 лентата. B: H3K27me3 ChIP се извършва при зрели адипоцити със или без третиране на 100 μmol/L SAH. Данните са средни ± SEM от три независими експеримента, всеки направен в дубликати. Статистическа значимост: спрямо съответния IgG ChIP, използвайки независима проба на Student t тест.

В светлината на тези констатации ние поставихме под въпрос дали медиираното от SAH намаляване на генната експресия е свързано с промени в репресивния хистонов знак H3K27me3. След клетъчна пролиферация и 5 дни диференциация в присъствието или отсъствието на 100 µmol/L SAH, адипоцитите са подложени на ChIP за H3K27me3. След това беше определено количеството експресия на гени Klf4, Cebpα и Rxrα, свързани с H3K27me3. Адипоцитите, изложени на продължително 100 µmol/L SAH, демонстрират значително увеличение на заетостта на H3K27me3 при промотора на гените Klf4 и Cebpα с четири пъти в сравнение с адипоцитите без експозиция на SAH (P = 0.000 и P = 0.01, съответно; Фиг. 4В). По подобен начин заетостта на H3K27me3 беше значително увеличена при промотора на Rxrα с двойно увеличение в адипоцитите, изложени на 100 µmol/L SAH, в сравнение с адипоцитите без експозиция на SAH (P = 0,003).