Резюме

Заден план

Диабетът тип 2 е сложно метаболитно разстройство, като затлъстяването е основен фактор, допринасящ за развитието му. Локусите на чувствителност за диабет тип 2 и затлъстяване са локализирани в различни хромозомни области чрез различни сканирания за обвързване на целия геном. От тези хромозомни региони 20q13 е един от най-силно свързаните региони за диабет тип 2, както и затлъстяване. На 20q13 лъжи DOK5 това изглежда силен функционален и позиционен кандидат за диабет тип 2 и затлъстяване поради участието му в инсулиновата сигнализация и имунните отговори. Следователно за първи път проучихме DOK5 като потенциален ген за диабет тип 2 и чувствителност към затлъстяване.

Методи

Секвенирахме 43 субекта за полиморфизми във функционално значими региони на DOK5. Общо 10 SNP, които включват 5, идентифицирани чрез секвениране, и 5 допълнителни SNP от базата данни за вариациите на NCBI са генотипирани при 2115 участници, състоящи се от 1073 пациенти с диабет тип 2 и 1042 контроли на индоевропейски етнически произход от Северна Индия.

Резултати

Идентифицирахме нов вариант в интрон 7, посочен като DK176673. Открихме номинална асоциация на три SNPs-rs6064099 (OR = 0.75, P = 0,019), rs873079 (ИЛИ = 0,76, P = 0,036) и DK176673 (ИЛИ = 1,55, P = 0,037) с диабет тип 2 сред пациенти с нормално тегло [ИТМ 2]. Хаплотипът GGC, съдържащ rs6068916, rs6064099 и rs873079, показва силна връзка с диабет тип 2 сред индивиди с нормално тегло (OR = 1,37, P/P къдрене = 5.8 × 10 -3 /0.037). Анализът на асоциацията със затлъстяването разкри, че rs6064099 е свързан с намалена чувствителност към затлъстяване (OR = 0,48, P = 6,8 × 10 -3). Също така, хаплотип GGC дава повишена чувствителност към затлъстяване (ИЛИ = 1,27, P/P къдрене = 9,0 × 10 -3 /0,039). Също така, rs6064099 е значително свързан с намален ИТМ [медиана (IQR) = 24,0 (20,7-27,1) срещу 23,9 (20,2-26,8) срещу 21,8 (19,2-24,7) за GG срещу GC срещу CC, P = 7,0 × 10 -3].

Заключения

Идентифицирахме се DOK5 като нов чувствителен ген за затлъстяване и диабет тип 2 при субекти в Северна Индия. Асоциация на DOK5 варианти както със затлъстяване, така и с диабет тип 2 предполага, че тези варианти могат да модулират чувствителността към диабет тип 2 чрез затлъстяване.

Заден план

Диабет тип 2 е сложно метаболитно разстройство, характеризиращо се с нарушена секреция и действие на инсулин. Затлъстяването е един от основните фактори, допринасящи за развитието на диабет тип 2. Въпреки че се смята, че се припокриват, етиологията както на диабет тип 2, така и на затлъстяването е неясна. Идентификацията на гените е важен крайъгълен камък в разбирането на патофизиологията на заболяването, но се оказа трудна задача за сложни разстройства като диабет тип 2. Счита се, че множество локуси на чувствителност в различни хромозомни области участват в генетичната етиология на диабет тип 2.

Доказателства за локализиране на локусите на чувствителност в различни хромозомни региони за диабет тип 2 и затлъстяване са предоставени от различни сканирания за връзка на целия геном. От тези региони 20q13 е един от най-силните региони-кандидати за диабет тип 2, за който е документирано, че е свързан с диабет тип 2 от повече от 8 проучвания с широк геном в различни популации [1–9]. Доказано е също, че същият регион е свързан със затлъстяването от различни изследвания [10–12]. До момента обаче няма ясни доказателства за локализиране на гени за диабет тип 2 и чувствителност към затлъстяване в този регион. Следователно, изследването на 20q13 чрез позиционен кандидат-подход може да улесни идентифицирането на гените за чувствителност към диабет тип 2 и затлъстяване в този регион.

Районът 20q13 пристанища DOK5 който кодира Dok5, който принадлежи към фамилията надолу по веригата на кинази (DOK), съдържаща тандем плекстрин хомология-фосфотирозин свързващи (PH-PTB) домени в N-терминала. Въпреки че биологичната функция на този докинг протеин не е много ясна, показа се, че Dok5 е един от субстратите в инсулиновата сигнализация [13]. Dok5 съдържа кратък С-край с потенциални места за фосфорилиране на тирозин, които се фосфорилират в отговор на инсулин и IGF1 [13]. Освен това, най-високата експресия на Dok5 е открита в скелетната мускулатура, която е основната тъкан, регулираща метаболитната хомеостаза. Предполага се също, че Dok5 участва в регулирането на имунния отговор, индуциран от Т клетки [14].

Поради участието си в инсулиновата сигнализация и имунните отговори, които са ключовите модулиращи пътища при диабет тип 2 и затлъстяване, DOK5 изглежда убедителен позиционен и функционален кандидат за диабет тип 2 и затлъстяване. Ето защо тук за първи път проучихме DOK5 като потенциален ген за диабет тип 2 и чувствителност към затлъстяване в популацията в Северна Индия, който има висок риск от развитие на диабет тип 2.

Методи

Набиране на субекти

Общо 2115 несвързани субекта, състоящи се от 1073 пациенти с диабет тип 2 и 1042 контролни субекти от Северна Индия, принадлежащи към индоевропейска етническа принадлежност, бяха включени след получаване на писмено информирано съгласие. Пациентите с диабет тип 2 са назначени от клиниката по ендокринология на Индийския институт по медицински науки, Ню Делхи, между периода 2003 и 2008 г. Диагностиката на диабет тип 2 е направена съгласно критериите на СЗО 2003 [15]. Контролните проби бяха събрани чрез организиране на „Лагери за осведоменост за диабета“ в градските райони в и около Делхи. Субекти на възраст ≥40 години без фамилна анамнеза за диабет, които са имали ниво на гликиран хемоглобин (HbA1c) ≤6.0% и ниво на глюкоза на гладно 2) и пациенти с наднормено тегло/затлъстяване (ИТМ ≥23 kg/m 2) [17]. Взети са проби от венозна кръв след нощно гладуване за биохимични измервания. Нива на глюкоза, HbA1c, инсулин, С-пептид, общ холестерол, триглицериди (TG), холестерол на липопротеините с висока плътност (HDL-C), холестерол на липопротеините с ниска плътност (LDL-C), урея, пикочна киселина, креатинин и hsCRP са измерени, както е описано по-рано [16, 18].

Скрининг и идентифициране на полиморфизми

За да идентифицираме нови варианти, ако има такива, ние секвенирахме приблизително 5 kb регион от DOK5 включително всички екзони, граници екзон-интрон, предполагаем промотор и UTR в 43 проби от индийския панел Discovery [19]. Използваните грундове са проектирани от Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3, който осигурява по-добър дизайн на грунда [20]. В секвенираните проби уловихме 9 SNP, включително един нов вариант в интрон 7 (хромозомна позиция 53 266 929), който никога не е бил докладван по-рано (наричан тук DK176673) (Фигура 1). От тях бяха избрани 5 SNP (rs6098099, rs6068915, rs6064099, DK176673, rs2840) за по-нататъшно генотипиране. Тъй като SNP в 3'UTR са много близки, само един SNP (rs2840) е генотипиран. Освен това бяха избрани още пет SNPs от базата данни за вариации на NCBI, която включва rs6098009, rs6023307, rs6023357, rs6023367 и rs873079, за да обхване целия ген въз основа на критериите за избор, които включват функционална значимост, хетерозиготност (MAF> 0,05), информация относно SNP на маркерите и разстояние между ОНП.

като

Генна структура на DOK5 представляващи SNP, идентифицирани в индийското население и избрани за анализ на асоциациите. За анализ на асоциирането са избрани SNP, маркирани със стрелка. * показва SNPs, избрани от бази данни с вариации на NCBI, докато други SNP са идентифицирани чрез директно секвениране на гена.

Генотипиране

Генотипизирането на тези 10 SNP се извършва с помощта на GoldenGate анализ на платформата Illumina (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Получените данни за генотипирането бяха подложени на обширен качествен контрол, който включва оценка на доверието на генотипа от 0,25, честота на разговорите> 0,9, оценка на GenTrans> 0,6, оценка на клъстерното разделяне> 0,4, MAF> 0,05 и равновесие на Харди-Вайнберг (HWE) в контролите (P > 0,01). От общите проби за контрол на случаите, 90 проби от ДНК имат генотип за по-малко от 90% от SNP и следователно са изключени. Общо 147 проби (7%) бяха генотипирани в дубликати и показаха степен на консистенция от 99,99% при генотипни обаждания. SNP rs2840 се провали в анализ Illumina и беше генотипизиран с помощта на MALDI-TOF масспектрометрия (Sequenom, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Статистически анализ

Отклонението от HWE във всеки локус беше тествано както между случаите, така и контролите поотделно, използвайки χ2 анализи. Свързването на генотипове с диабет тип 2 и затлъстяване беше оценено чрез логистична регресия. Анализите на асоцииране на генотипове с диабет тип 2 също бяха извършени след стратификация на случаите и контролите на субекти с нормално тегло и наднормено тегло/затлъстяване. Анализите бяха коригирани според възрастта, пола и ИТМ според случая. Съотношенията на коефициентите (OR) са представени по отношение на малките алели. Bonferroni корекция беше приложена за коригиране на множество сравнения и a P стойност

Резултати

DOK5 полиморфизми

Идентифицирахме общо 9 SNPs след секвениране на функционално значимите региони на DOK5 включително един нов SNP в интрон 7 (наричан DK176673) и 8 докладвани SNPs-rs6098099 (Intron 5), rs6068915 (Intron 5), rs6064099 (Intron 6), rs2840 (5'UTR), rs2842 (5'UTR), rs2841 (5'UTR), rs15899 (5'UTR) и rs2843 (5'UTR) (Фигура 1). Тъй като 5-те SNP, идентифицирани в 5'UTR региона, бяха много близо един до друг, само един (rs2840) беше избран за по-нататъшно генотипиране. Следователно, от 9 идентифицирани SNPs, 5 SNPs-rs6098099, rs6068915, rs6064099, DK176673, rs2840 са избрани за по-нататъшно генотипиране. Освен това, още пет SNPs от базата данни на NCBI Variation, която включва rs6098009 (Intron 1), rs6023307 (Intron 1), rs6023357 (Intron 2), rs6023367 (Intron 2) и rs873079 (Intron 7), също бяха избрани за пълното покритие на генния регион.

DOK5 полиморфизми и диабет тип 2

Общо 10 SNPs са генотипизирани в изследваната популация от 2 115 участници, състояща се от 1073 пациенти с диабет тип 2 и 1042 контроли от индоевропейски етнически произход от Северна Индия. Клиничните характеристики на изследваната популация са представени в Таблица 1. Всички SNP са в съответствие с HWE (всички P > 0,01) както сред случаите, така и сред контролите, с изключение на rs2840, който е елиминиран от допълнителен анализ. Установено е, че SNPs-rs6098009, rs6023307 и rs6098099 са редки варианти (MAF Таблица 1 Антропометрични и клинични характеристики на изследваната популация

SNPs rs6064099 и rs873079 бяха в силна LD (D '= 0.98 и r 2 = 0.91). Сред индивидите с нормално тегло хаплотипът GGC, съдържащ основни алели на rs6068916, rs6064099 и rs873079, е по-често сред пациентите с диабет тип 2 (66,9%) в сравнение с контролните субекти (59,8%). Установено е, че GGC хаплотипът придава повишена чувствителност към диабет тип 2 (OR = 1,37, P/P къдрене = 5.8 × 10 -3 /0.037) сред индивиди с нормално тегло (Таблица 3). Друг хаплотип CTT, обхващащ rs6064099, rs873079 и DK176673, показва намаляване на чувствителността към диабет тип 2 сред субекти с нормално тегло, но не остава значим след анализи на пермутации (хаплотипни честоти от 19,5% и 24,1% сред пациенти и диабет тип 2 съответно; OR = 0,76, P/P къдрене = 0,038/0,242).

DOK5 полиморфизми и затлъстяване

Асоциация на DOK5 варианти със затлъстяване се оценява чрез разглеждане на ИТМ както като непрекъсната, така и като дискретна характеристика (≥23 kg/m 2) сред контролните субекти. SNP rs6064099 е значително свързан с намален ИТМ [медиана (IQR) = 24,0 (20,7-27,1) срещу 23,9 (20,2-26,8) срещу 21,8 (19,2-24,7) за GG срещу GC срещу CC, P = 7,0 × 10 -3]. Разглеждайки ИТМ като дискретна черта, наблюдаваме значителна връзка на rs6064099 със затлъстяването (OR = 0,48, P = 6,8 × 10 -3), които остават значими след корекция на възрастта и пола (P = 9,8 × 10 -3). Открихме също значителна връзка на гаплотипа GGC със затлъстяването. GGC хаплотипът е свръхпредставен сред лица с наднормено тегло/затлъстяване (65,4%) в сравнение с индивиди с нормално тегло (59,7%), което създава риск за затлъстяване с OR от 1,27 [P = 9,0 × 10 -3 /P къдрене = 0,039].

DOK5 полиморфизми и количествени клинични черти

Освен това разследвахме асоциирането на DOK5 SNPs с количествени признаци, свързани с диабет тип 2, включително глюкоза на гладно, HbA1c, инсулин, C-пептид, hsCRP, общ холестерол, HDL, LDL, триглицериди, креатинин, урея и пикочна киселина. Поради това клиничните променливи само на контролните субекти бяха сравнени между генотиповете на SNP, тъй като състоянието на заболяването или режимът на лечение при пациентите може да повлияе на оценката на тези параметри. Нито един от SNPs не е установен, че е значително свързан с клиничните черти, разследвани тук (всички P > 0,05).

Дискусия

Индийското население представлява най-рисковата група за диабет тип 2 и свързаните с него метаболитни характеристики, включително затлъстяване и сърдечно-съдови заболявания. Редица проучвания за асоцииране са проведени в индийската популация, за да се оцени ролята на функционалните кандидат-гени, повечето от които включва репликация на асоциации в други популации. Освен това, тези усилия не са дали гена на истинска чувствителност, който причинява диабет тип 2 в тази високорискова група. С появата на проучвания за асоцииране в целия геном (GWA), внезапно се увеличи броят на потвърдените локуси за диабет тип 2 [26]. Тези идентифицирани локуси обаче допринасят само за малка част от очаквания брой ангажирани гени [27]. Следователно, наред с моделния подход на изследванията на GWA, позиционният кандидат-подход, насочен към гени с правдоподобна функционална значимост, може значително да допринесе за по-доброто разбиране на сложните нарушения. Следователно тук изследвахме потенциален позиционен и функционален кандидат-ген, DOK5 върху хромозомна област 20q13, за идентифициране на нов ген за чувствителност към диабет тип 2 и затлъстяване.

Анализ на асоциацията на DOK5 SNPs разкриха значителна връзка на неговите варианти с диабет тип 2 сред лица с нормално тегло. Установено е, че SNPs rs6064099 в интрон 6 и rs873079 в интрон 7 намаляват чувствителността към диабет тип 2 сред индивиди с нормално тегло. Също така беше установено, че новият SNP DK176673 придава чувствителност към диабет тип 2. Установено е, че индивидите с нормално тегло, съдържащи хаплотип GGC на основните алели за SNPs rs6068915, rs6064099 и rs873079, са по-податливи на диабет тип 2. Следователно, нашите данни предполагат това DOK5 може да играе важна роля в модулирането на чувствителността на диабет тип 2 сред индивиди с нормално тегло в популацията в Северна Индия. Нашето проучване допълнително засилва нашите по-ранни наблюдения, че етиологичните механизми на патофизиологията на диабет тип 2 зависят от ИТМ [11, 24].

В съответствие с по-ранни наблюдения на връзката на 20q13 със затлъстяването, нашето проучване също така предоставя допълнителни доказателства за локализацията на гена за чувствителност към затлъстяването в този регион. Открихме силна връзка на rs6064099 със защита срещу затлъстяване. Също така е установено, че GGC хаплотипът придава повишена податливост на затлъстяване. Асоциация на DOK5 варианти със затлъстяване отново предполага, че тези варианти могат да модулират чувствителността към диабет тип 2 чрез затлъстяване.

Интересно е да се отбележи, че GGC хаплотипният регион, съдържащ три SNPs rs6068916, rs6064099 и rs873079, обхваща екзони 6 и 7 от гена DOK5. В случай, че тези асоциирани SNP не са истински причинно-следствени варианти, може да има причинно-следствен или функционално значим вариант при LD със свързаните SNP, влияещи на риска от диабет тип 2 и затлъстяване. Въпреки че се опитахме да идентифицираме всички полиморфизми в екзоничните региони, може да има възможност за по-рядко срещани варианти с по-високи относителни рискове в тези региони, които да не могат да бъдат уловени в нашите секвенирани проби. Следователно, по-нататъшна оценка на SNP в DOK5 в по-голяма популация може да осигури истински вариант на чувствителност през DOK5 ген.

Тук бихме искали да споменем, че производството на фалшиви положителни резултати при проучвания на асоциации поради стратификация на популацията и многобройни сравнения може да е правдоподобно. Имайки това предвид, нашите случаи и контролни субекти бяха наети от хомогенен клъстер в градския регион на Северна Индия в съответствие с доклад за генетичния пейзаж на хората в Индия [28]. От модела на клъстериране се предполага, че ако и двата случая и контрола са взети от един и същ клъстер, ефектите от стратификацията на популацията в проучванията за асоцииране на заболявания могат да бъдат малки. Друго проучване, анализиращо индийските генетични вариации и разнообразие, също така предполага, че ефектите от хетерогенността на популацията върху производството на фалшиви положителни резултати в проучванията за асоцииране могат да бъдат по-малки при индийците, отколкото би могло да се очаква за такава географски и езиково разнообразна подгрупа от човешката популация.

Заключения

В заключение идентифицирахме DOK5 като нов ген, модулиращ чувствителността към затлъстяване и диабет в северноиндийската популация от индоевропейска етническа принадлежност. Въпреки това, репликационните анализи на вариантите, показващи асоциация в това проучване, са оправдани, за да потвърдят констатациите. Освен това други генетични варианти в гена също могат да играят роля за повлияване на риска от диабет тип 2. Следователно, бъдещи генетични и функционални изследвания, оценяващи връзката на генетичните варианти на DOK5 и дешифрирането на техния физиологичен ефект и механизмите са необходими за по-нататъшно установяване на неговата роля в проявата на диабет тип 2.

Съкращения

Докинг протеин 5

Инсулин като фактор на растежа 1

плекстрин хомология-фосфотирозин свързващ домен