Судхарсана Рао Анде

1 Катедра по вътрешни болести, Университет в Манитоба, Уинипег, R3E 3P4, Канада

Хан Хоа Нгуен

1 Катедра по вътрешни болести, Университет в Манитоба, Уинипег, R3E 3P4, Канада

Ян Син Зи Сю

1 Катедра по вътрешни болести, Университет в Манитоба, Уинипег, R3E 3P4, Канада

Суреш Мишра

1 Катедра по вътрешни болести, Университет в Манитоба, Уинипег, R3E 3P4, Канада

2 Катедра по физиология и патофизиология, Университет в Манитоба, Уинипег, R3E 0J9, Канада

РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛТАТИ

Затлъстяването при женски мишки Mito-Ob води до намалена плодовитост, образуване на кисти на яйчниците и безплодие

Наскоро съобщихме за нов трансгенен модел на затлъстели мишки (Mito-Ob), разработен чрез свръхекспресия на прохибитин в адипоцитите (Ande et al., 2014). На 6-месечна възраст мишките Mito-Ob са имали значително по-високо телесно тегло, което се отразява от увеличената висцерална и подкожна мастна тъкан с хипертрофирани адипоцити (Ande et al., 2014). По време на последващи проучвания върху мишки Mito-Ob, забелязахме значително намаляване на плодовитостта със стареене в сравнение с мишки от див тип, а женските мишки Mito-Ob бяха безплодни до 9-месечна възраст (фиг. 1 А). Наблюденията за намалена плодовитост и последваща загуба на плодовитост при мишките на Mito-Ob ни подтикнаха да изследваме фенотипа на яйчниците на мишките от мито-об. На 9-месечна възраст яйчниците от ~ 25% от мито-Ob мишките бяха значително увеличени, поради образуването на морфологично очевидни кисти на яйчниците, пълни със серозна течност (фиг. 1 Б), което не се наблюдава при яйчниците от диво- тип мишки. Кистите на яйчниците при мишките Mito-Ob често се развиват двустранно.

ановулация

Хистологичният анализ на яйчниците от мишки Mito-Ob потвърди образуването на киста на яйчниците (фиг. 2 А, Б). Освен това яйчниците бяха заобиколени от свръхрастеж на мастна тъкан и периовариална мастна тъкан, тясно свързани с повърхността на яйчниковия епител (Фигури 2 А, В и и 3). 3). Спирането на фоликуларното развитие и намаляването на броя на жълтото тяло или тяхното отсъствие е очевидно в яйчниците на мишките Mito-Ob (Фигури 2 A, B и and3). 3). С увеличаването на размера на кистата на яйчниците беше установено, че масата на яйчниковата тъкан се изтласква на една страна и се компресира в резултат на значително увеличаване на кистите на яйчниците от едната страна и свръхрастеж на периовариална мастна тъкан от другата страна (Фигури 2 Б и и3 3).

Хистологично оцветяване, показващо промени в структурата на яйчниците при мишки Mito-Ob и тясна връзка между яйчниците и периовариалната мастна тъкан. Представителни микрофотографии, показващи оцветени с H & E овариални разрези от мишки (A) Wt и Mito-Ob на 3 и 9 месечна възраст, (B) безплодна мишка Mito-Ob на 9 месечна възраст. Десният панел показва увеличен изглед на полето в полето в левия панел (n = 6 мишки/група). Ad, мастна тъкан; Ov, яйчник; звездичка, киста на яйчника.

Хистологично оцветяване на яйчници от безплодни мито-мишки, показващи тясна връзка между яйчниците и периовариалната мастна тъкан. Представителни микрофотографии на яйчници от 9-месечни мишки Mito-Ob, показващи кисти на яйчниците на различни етапи от тяхното развитие. За подобряване на визуализацията на мастната тъкан се използва син филтър. Десните панели показват увеличени изгледи на полетата в полетата в левия панел. Стрелката показва силно удължена стена на киста на яйчника; стрелката показва тясна връзка между повърхността на яйчниците и периовариалната мастна тъкан (n = 6). Ad, мастна тъкан; CL, жълто тяло; Ov, яйчник; звездичка, киста на яйчника.

Затлъстяването не засяга хомеостазата на глюкозата и чувствителността към инсулин по време на развитието на безплодие при женски мишки Mito-Ob

Наскоро съобщихме, че затлъстяването при женски мишки Mito-Ob няма ефект върху хомеостазата на глюкозата и чувствителността към инсулин на 6-месечна възраст (Ande et al., 2014). За да се избегне сравнение с предишното проучване и да се определи метаболитният статус по време на безплодие, свързано със затлъстяването, ние измерихме глюкозната хомеостаза при мишки Mito-Ob на 9-месечна възраст. Не открихме разлики в глюкозния и инсулиновия толеранс между мишките Mito-Ob и мишките от див тип (фиг. 4 А, ляво и дясно). В съответствие с нормалната глюкозна хомеостаза и инсулиновата чувствителност, ние не открихме значителни разлики в нивата на гладно и хранене на серумен инсулин между мито-об и мишки от див тип (фиг. 4 Б, вляво). По същия начин нивата на лептин и резистин не се различават значително между мишките Mito-Ob и див тип, докато нивата на адипонектин са по-високи при мишките Mito-Ob в сравнение с мишките от див тип (фиг. 4 В, вдясно). Като цяло тези данни предполагат, че хомеостазата на глюкозата и чувствителността към инсулин остават нормални по време на свързаната със затлъстяването дисфункция на яйчниците и безплодие при мишки Mito-Ob.

Метаболитен фенотип и нива на хормони при женски мишки Mito-Ob по време на развитието на киста на яйчника. (A) Линейните графики, показващи теста за глюкозен толеранс (GTT, вляво) и инсулиновия толеранс (ITT, вдясно), водят до 9-месечни мишки Mito-Ob в сравнение с мишки Wt. Данните са представени като средно ± s.e.m. (п = 6 мишки/група). (B) Хистограми, показващи нива на инсулин на гладно и хранене (вляво) и различни нива на хормони (вдясно) при мишки Mito-Ob и Wt мишки. Данните са представени като средно ± s.e.m. (п = 6 мишки/група). NS, не е значимо от t-теста на Student между мишки Mito-Ob и Wt. МО, Мито-Об.

Нивата на лутеинизиращ хормон (LH) и тестостерон остават нормални по време на развитието на киста на яйчниците при мишки Mito-Ob

Хиперандрогенизмът и хиперинсулинемията се считат за важни фактори, допринасящи за развитието на СПКЯ при жените (Restuccia et al., 2012). Нашите открития за нормални нива на инсулин и инсулинова чувствителност, заедно с ановулация и поликистозни яйчници, при мишки Mito-Ob ни подтикнаха да измерваме нивата на LH и тестостерон при женски мишки Mito-Ob. Не наблюдавахме значителни разлики в серумните нива на LH и тестостерон между мишките Mito-Ob и див тип (фиг. 5), въпреки че нивата на двата хормона бяха по-ниски при мишките Mito-Ob, отколкото при мишки от див тип. Взети заедно, тези данни предполагат, че свързаните със затлъстяването дисрегулация на яйчниците и безплодие при мишки Mito-Ob се развиват независимо от хиперинсулинемия и високи нива на андроген.

ДИСКУСИЯ

Хиперандрогенизмът е най-постоянната характеристика на жените с СПКЯ (Abbott et al., 2002). Не е ясно обаче дали хиперандрогенизмът е причина или последица от СПКЯ, въпреки че са разработени редица индуцирани от андроген животински модели на СПКЯ, което предполага, че андрогените са важен фактор за развитието на СПКЯ (ван Хутен и Visser, 2014; Walters et al., 2012). В този контекст е важно да се отбележи, че подобни ефекти на андрогените са ограничени до конкретни етапи от процеса на развитие (van Houten and Visser, 2014). Тъй като източникът и времето на такива ефекти на хиперандрогенизма при развитието на PCOS при жените не са ясни, не може да се изключи възможността за андроген-независима етиология на човешкия PCOS. Освен това, високите нива на андроген, които обикновено се наблюдават при пациенти със СПКЯ, може да са вторични за развитието на СПКЯ. Например, хиперинсулинемията може да допринесе за хиперандрогения чрез действието си върху тека клетките при пациенти с PCOS. Поликистозният фенотип на яйчниците на мишките Mito-Ob отваря възможност за изследване на андроген-независимото развитие на поликистоза на яйчниците.

В допълнение към мишките Mito-Ob, наскоро съобщихме за мутантна мишка Mito-Ob, експресираща фосфо мутантна (Y114F) форма на прохибитин по подобен начин (Ande et al., 2016). Мутантните мишки Mito-Ob споделят затлъстяването и метаболитния фенотип на мишките Mito-Ob, но развиват тумори на лимфни възли само при мъже, което предполага защитна роля на естрогена в свързаната със затлъстяването метаболитна дисрегулация и развитието на тумора (Ande et al., 2016) . Както се спекулира, беше установено, че овариектомията при мутантни мито-Ob мишки нарушава метаболитната дисрегулация и развитието на тумори на лимфните възли (Ande et al., 2016), потвърждавайки защитната роля на естрогена при тези мишки. Освен това, мутантните мишки Mito-Ob показват ановулация и поликистозни яйчници, подобни на женските мишки Mito-Ob (S.M., непубликувани данни). Развитието на поликистозни яйчници при мутант-мито-мишки мишки допълнително подкрепя констатациите на мишки мито-об, че свръхрастежът на периовариалната мастна тъкан и повишеният естрадиол могат да причинят дисрегулация на яйчниците и безплодие, включително поликистоза на яйчниците.

Очаква се, че спонтанните модели на свързана със затлъстяването ановулация и поликистоза на яйчниците, описани тук, ще бъдат ценни за изследване на основните механизми, свързани с ановулацията, свързана със затлъстяването, и разстройства на яйчниците. По този начин, мишките Mito-Ob ще бъдат полезни за разпознаване на относителния принос на различни фактори, които съвместно съществуват при свързани със затлъстяването нарушения на яйчниците.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Поколение на трансгенни мито-мишки

Генерирането на трансгенни мишки с мито-Ob свръхекспресия на прохибидин в адипоцити е описано другаде (Ande et al., 2014). Всички отчетени тук работи с животни са извършени съгласно протокола за изследване, одобрен от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните към Университета в Манитоба, Канада. За сравнение между мито-об и мишки от див тип, мъжки мишки от мито-об бяха отглеждани с див тип CD-1 женски мишки, за да генерират хемизиготни мишки от мито-об и мишки от див тип от същото котило. По този начин контролните мишки от див тип са с идентичен генетичен произход на трансгенните мишки Mito-Ob. Трансгенните мишки на Mito-Ob са идентифицирани чрез генотипиране на опашната ДНК, като се използва полимеразна верижна реакция (PCR) със следните праймери: праймер: 5′-GCAGCCCGGGGATCCACTA-3 ′ и 5′-GCACACGCTCATCAAAGTCCTCTCCGATGCTG-3 ′. Мишките Mito-Ob и див тип бяха настанени на малки групи с 12-часови цикли на тъмна светлина и с достъп до храна и вода ad libitum.

Западна имуноблотинг

Лизатите на матката и яйчниците от Mito-Ob и мишки от див тип, съдържащи равни количества протеини (15 mg/лента), бяха разделени чрез електрофореза на полиакриламиден гел натриев додецил сулфат (SDS-PAGE) и впоследствие анализирани чрез имуноблотинг с използване на анти-прохибитин антитяло ( Ande et al. 2014).

Хистология

Яйчниците от 3- до 9-месечни Mito-Ob и мишки от див тип бяха фиксирани за една нощ в 10% буфериран формалдехид и впоследствие дехидратирани в степенувана серия етанол, преди да бъдат вградени в парафин. Пет-микрометров овариален разрез бяха изрязани и обработени за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) (Lei et al., 2001; Nguyen et al., 2011).

Измерване на серумните хормони и адипокин

Нивата на серумен инсулин и адипокин бяха измервани с помощта на миши Bio-Plex Pro ™ панели за диабет за анализ и системи за мултиплексни суспензионни масиви Bio-Plex 200 ™ (Bio-Rad) съгласно протоколите на производителя (Ande et al., 2014, 2016). Нивата на LH (USBiological, Swampscott, MA, USA) и половите стероидни хормони (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) бяха измерени с помощта на налични в търговската мрежа комплекти съгласно протоколите, предоставени от производителя.

Тестове за глюкоза и инсулинов толеранс

Тестовете за толерантност към глюкоза и инсулин при 9-месечни мишки Mito-Ob и съответстващите им дичи типове са направени съгласно стандартните процедури, описани в предишните ни публикации (Nguyen et al., 2011; Ande et al., 2014).

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA, USA). Експерименталните резултати са показани като средно ± s.e.m. Бяха проведени двустранни t-тестове на Student с двойка, за да се сравнят Mito-Ob и диви тип отпадъци, освен ако не е посочено друго. P Бележки под линия

Конкуриращи се интереси

Авторите не декларират конкурентни или финансови интереси.