Субекти

Авторска корекция на тази статия е публикувана на 27 юли 2018 г.

Тази статия е актуализирана

Резюме

Въведение

Активната пролиферация и диференциация на преадипоцитите малко преди раждането и през първите няколко години от живота създава чувствителен прозорец за мастно развитие 1,2,3. Следователно, майчината диета и вътреутробната среда могат да повлияят на отлагането на мазнини и произтичащия риск от затлъстяване. Мастната тъкан е обект на програмиране за развитие, при което експозициите в утробата оказват траен ефект върху фенотипите на тъканите. Вариациите в диетата на майката, начина на живот и експозицията на околната среда са свързани с повишено затлъстяване по-късно в живота чрез стабилни ефекти върху растежа и метаболизма на адипоцитите 4,5,6. Програмирането на мастната тъкан представлява особен интерес за общественото здраве, тъй като затлъстяването, което е епидемия в САЩ и в световен мащаб, започва в началото на живота. Приблизително 27% от децата в САЩ са с наднормено тегло или затлъстяване до петгодишна възраст 7. Децата със затлъстяване са много по-склонни да бъдат затлъстели като възрастни в сравнение с децата с нормално тегло 8,9. Следователно ограничаването на натрупването на излишни мазнини през първите няколко години от живота е важен инструмент за профилактика на затлъстяването при възрастни. Доказателствата, че затлъстяването при раждане предсказва затлъстяване по-късно в детството, подчертават необходимостта от разбиране на пренаталните фактори, които влияят върху развитието на мастната тъкан 10,11 .

Avians осигуряват уникален модел, в който да се манипулира специално групата мастни киселини, които се доставят на ембриона, и да се тестват ефектите върху мастното отлагане след излюпването (т.е. раждането). Жълтъкът осигурява по-голямата част от мастните киселини на развиващите се тъкани в ембриона и за един до два дни след излюпването, докато се установи храненето. Профилът на мастните киселини на жълтъка може да бъде променен чрез източника на хранителни мазнини, предоставен на кокошката 22,23. Например търговските яйца, обогатени с EPA и DHA, се произвеждат чрез допълване на диетата на кокошките с морски масла. Използвахме тази връзка, за да проверим хипотезата, че обогатяването на ембриона с EPA и DHA, доставяно в рибено масло (FO), намалява отлагането на мазнини при пилетата. Царевичното масло (CO) е използвано като еталон, тъй като съдържа сравнимо ниво на PUFA (

60%), но предимно тези от семейство n-6. Всички пилета са хранени с диета на основата на CO след излюпване, за да ограничат експерименталната манипулация до периода на ембрионално развитие. Демонстрираме, че храненето на майката с ФО значително намалява затлъстяването след излюпване, без ефект върху растежа. Нашите резултати показват, че мастните киселини в майчината диета допринасят за програмирането на развитието на мастната тъкан.

Резултати

Производство на яйца и състав на мастни киселини в пилешки тъкани

Излюпимостта, теглото на яйцата и теглото на пилетата при излюпване бяха използвани за оценка на ефекта от диетата с кокошки върху качеството на яйцата, като нито едно от тях не се различава значително между яйцата от кокошките CO и FO (P > 0,05). Съставите на мастните киселини на фосфолипидите, съдържащи се в мозъка и черния дроб, бяха профилирани и качествено сравнени, за да се потвърди, че EPA и DHA са обогатени в тъкани на пилета FO, в сравнение с пилета CO, при излюпване. Мозъкът и черният дроб са били използвани поради относителната им маса при излюпване. Нивата на обогатяване на видовете фосфатидилхолин (PC), съдържащи EPA и DHA, са показани в таблица 1. Увеличението на гънките (FO/CO) варира от

1,2 (18: 0/22: 6 в мозъка) до

130,4 (PC 18: 4/22: 6 в черния дроб), с повече от 2-кратно обогатяване за повечето видове. Тези данни потвърждават, че профилът на мастна диета при майката е отразен в състава на мастните киселини в тъканите на получените пилета по време на излюпването.

Ефектът на майчиния източник на мастни киселини върху състава на мастните киселини върху развиващата се мастна тъкан е количествено определен с помощта на GC-FID. Съставът на мастните киселини на общата липидна фракция на коремната мастна тъкан се анализира на 7 и 14 d възраст (Таблица 2). Изобилието на пет мастни киселини (палмитолеинова, у-линоленова, ейкозенова, ейкозадиенова и докосадиенова киселини) се увеличава с възрастта (PВъзраст Таблица 2 Съдържание на мастни киселини в мастната тъкан в корема на пилета-бройлери, произведени от кокошки, хранени с диети, съдържащи CO или FO за 28 дни.

Телесно тегло и отлагане на мазнини

Подкожната мастна тъкан при пилетата се развива в ембриона и се вижда при излюпването, докато коремното депо се развива през първите няколко дни след излюпването. Теглото на двата депа е измерено, за да се оцени ефектът на FO в майчината диета върху отлагането на мазнини в потомството. Теглото на тялото не се различава значително между пилета CO и FO нито на 7, нито на 14 дни (Таблица 3). Приемът на храна не се различава между пилетата CO и FO (данните не са показани). Източникът на мастни киселини при майките регулира затлъстяването на двата депа по специфичен за възрастта начин. На 7 d подкожно и коремно затлъстяване не се различава значително между пилета FO и CO (P > 0,05). Относителните тегла на двата склада обаче са значително намалени при пилета FO спрямо CO (P Таблица 3 Ефект от обогатяването на диетата върху производителността и серумните метаболити на пилета-бройлери, произведени от кокошки, хранени с диети, съдържащи CO или FO за 28 дни.

консумация

Потенциалните механизми за разликата в затлъстяването бяха оценени въз основа на експресия на гени, които медиират метаболизма на мастните киселини и адипогенезата. Както е показано на фиг. 3А, мастната тъкан от пилета FO експресира значително по-ниски нива на гама рецептор, активиран от пероксизомен пролифератор (PPARG) и неговия коактиватор PPARGC1B (PPARG коактиватор 1 β), отколкото тъкан от CO пилета (P 0,05). Черният дроб е основното място на de novo липогенеза при птиците (както при хората) 24 и играе важна роля при отлагането на мазнини при пилетата бройлери 25. Диетата не повлиява значително изражението на CPT1, ACOX1 и FASN в черния дроб (фиг. 3С), съответстващо на съпоставимо съдържание на чернодробни триглицериди при пилета FO и CO (данните не са показани).

Мастна протеомика

Протеомите на мастната тъкан от пилета FO и CO бяха анализирани чрез LC-MS/MS и сравнени, за да се идентифицират допълнителни пътища, които бяха променени от FO хранене на майката. Общо 95 известни протеина се различават значително (P Таблица 4 Диференциално експресирани протеини в коремната мастна тъкан на пилета FO срещу CO на 14 d.

Дискусия

Много ранното поява на затлъстяване при децата подчертава необходимостта да се разбере как диетата и начинът на живот на майката влияят върху натрупването на мазнини след раждането. Това проучване запълва празнина в знанията, като демонстрира, че видовете мастни киселини, доставяни на развиващия се ембрион преди раждането, влияят върху развитието на мазнините. По-конкретно, обогатяването на диетата на майките с FO намалява затлъстяването на пилетата в сравнение с диетата на майката, базирана на CO. Всички пилета са хранени с диета на основата на CO след излюпване, ограничавайки диетичната манипулация до периода преди излюпването. Протоколът за хранене, който използвахме, беше разработен за обогатяване на яйца за потребителския пазар в DHA и EPA. Въпреки че не измервахме жълтъчни мастни киселини, открихме значително обогатяване на EPA и DHA в черния дроб и мозъчните фосфолипиди при излюпване, което показва, че диетата обогатява развиващия се ембрион, както се очаква.

Преминаването към увеличени малки адипоцити, съчетано с понижено регулиране на експресията на PPARG и неговия коактиватор PPARGC1B предполагат, че FO на майката намалява затлъстяването отчасти чрез инхибиране на прогресията чрез адипогенеза. EPA и DHA могат да действат като лиганди за активиране на PPARG, което се очаква да стимулира адипогенезата чрез ролята на този ядрен рецептор в организирането на диференциацията на адипоцитите. въпреки това, инвитро проучванията показват както про-, така и антиадипогенни ефекти на EPA и DHA, което може да се дължи на вариации в клетъчните линии, протоколи за диференциация, референтни лечения и концентрации на мастни киселини 30,31,32. Интересното е, че преминаване към повишена честота на малките адипоцити и повишена експресия на PPARG е описан при мишки с мазнини-1, които ендогенно синтезират n-3 PUFA поради трансгенна експресия на нова десатураза на мастни киселини от C. elegans 33. Данните от микрочипове показват, че конститутивният синтез на n-3 PUFAs в адипоцитите на мазнини-1 мишки значително потиска експресията на GATA свързващ протеин 3, който обикновено инхибира прогресията на преадипоцитите в диференциация чрез директно потискане на PPARG 34 .

Предстои да бъдат определени механизмите, чрез които консумацията на LC n-3 PUFA от майката може да намали затлъстяването при потомството. Контролът на транскрипцията чрез PPARs от EPA, DHA и техните метаболити ще изисква продължително обогатяване на тези мастни киселини в мастната тъкан. Профилирането на мастни киселини демонстрира, че общият липиден пул на пилетата FO е обогатен както с EPA, така и с DHA до 14 дни, въпреки че обогатяването на гънките спрямо групата на CO намалява между първата и втората седмица. Колко дълго продължава това обогатяване, особено когато диетата след излюпването не е допълнена с FO, остава да се определи. Епигенетичните модификации на гени, участващи в отлагане на мазнини, също могат да бъдат в основата на намаленото затлъстяване при пилетата FO. В скорошно рандомизирано, контролирано клинично проучване, добавянето на рибено масло по време на бременност диференцирано метилира 21 хромозомни области при раждането, като някои разлики продължават до 44-годишна възраст. Циркулиращите нива на DHA, както в началото на бременността, така и при раждането, са в значителна корелация с метилирането на PPAR-α при бебета 45, което показва потенциала за епигенетично програмиране на липидния метаболизъм. Интересното е, че изобилието от каталитична субединица 2 за редактиране на ензим на аполипопротеин В иРНК (APOBEC2) е значително намалено (

16 пъти) в FO срещу CO мастна тъкан, според нашите протеомични данни. Този ензим е част от координирана ДНК деметилазна система, която регулира съдбата на клетките в развиващия се ембрион чрез епигенетична модификация 46. Експресията на APOBEC2 е свързана предимно със скелетната мускулатура, в която е свързана с диференциацията на миобластите, но се изразява и в мастната тъкан при пилетата 47. Ако храненето на майката с ФО намалява затлъстяването чрез епигенетични механизми, които често са стабилни, това има важни последици за нови средства за контрол на детското (и потенциално възрастно) затлъстяване. Необходими са последващи проучвания, за да се характеризират моделите на метилиране и други епигеномни белези на храненето на майката с FO, за да се проучи тази възможност.

В обобщение, нашите данни показват, че консумацията на рибено масло при майките намалява отлагането на мазнини при потомството. Нашето проучване беше ограничено до първите две седмици от живота и са необходими последващи експерименти, за да се определи колко дълго този ефект продължава, когато пилетата узреят. Тези резултати допълват скорошни проучвания при хора, които свързват LC n-3 PUFA в майчината диета с намалена мастна маса при деца. Съответно, те подчертават потенциала за намаляване на натрупването на мазнини и потенциално риска от затлъстяване в детска възраст чрез диетична намеса преди раждането.

Методи

Диети и отглеждане

Събиране на кръв и тъкани

Пилетата бяха евтаназирани чрез задушаване на CO2. Две пилета от всяка група бяха евтаназирани при люка за събиране на черен дроб и мозък за липидни анализи. Пробите от всяка тъкан се замразяват бързо и се съхраняват при -80 ° C. Останалите пилета бяха евтаназирани на 7 и 14 d възраст. По време на евтаназия кръв се събира чрез сърдечна венепункция и се прехвърля в 10 ml серумни сепараторни епруветки (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Серумът се отделя чрез центрофугиране и се съхранява при -80 ° C до анализи на циркулиращи метаболити. Коремните и бедрените (подкожни) мастни депа се дисектират и претеглят като индекси на затлъстяване. Впоследствие пробите от всяко депо и от черен дроб бяха бързо замразени в течен азот и съхранявани при -80 ° C. Проби от коремна мастна тъкан се фиксират за 24 h при 4 ° C в параформалдехид (4%) за определяне на размера на адипоцитите по хистология.

Серумни метаболити

Наличните в търговската мрежа колориметрични комплекти за анализ бяха използвани за измерване на нивата на серумна глюкоза (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) и неестерифицирани мастни киселини (NEFA) (Wako Chemicals, Neuss, Германия).

Анализ на мастни киселини

Анализ на фосфолипидите

Съставът на мастните киселини на видовете фосфатидилхолин в мозъка и черния дроб, събрани при излюпване (n = 2/диета) и в коремната мастна тъкан, събрани на 7 d възраст (n = 5/диета), беше анализиран с помощта на UltraHigh Performance Liquid Chromatograph (UHPLC) -MS (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). Пробите от тъкани (100 mg) се пулверизират под течен азот с помощта на хаванче. Фосфолипидите бяха извлечени с помощта на модифициран протокол Bligh and Dyer 65. Изсушените екстракти се суспендират отново в 300 μL метанол/хлороформ (9: 1) за UHPLC-MS анализ, както е описано по-рано 66. Видовете липиди бяха идентифицирани с помощта на точни m/z и времена на задържане. Липидните стандарти (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL) от всеки клас фосфолипиди бяха проведени, за да се провери времето на задържане. Цялата йонна фрагментация се използва, за да се потвърди, че фосфатидилхолините съдържат DHA и EPA като ацилни вериги. За всички сканирания на йонна фрагментация разделителната способност беше 140 000 с обхват на сканиране 100-1500 m/z. Нормализираната енергия на сблъсъка е 30 eV със стъпкова енергия на сблъсък от 50%. Липидите са идентифицирани по техните фрагменти с помощта на софтуера Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, Сан Хосе, Калифорния). Анализът на данните е извършен с помощта на софтуера Maven 67 .

Размер на адипоцитите

Проби от коремна мазнина от три птици на диета във всяка от двете възрасти бяха вградени, разделени и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E; две предметни стъкла/птица) за определяне на размера на адипоцитите, както е описано по-рано от 53. Използвани са трите птици със стойности на затлъстяване, най-близки до средната затлъстяване във всяка диета/възрастова група. Накратко, изображенията на три независими полета на слайд бяха заснети на всеки слайд под 20-кратно увеличение с микроскопа EVOS XL Core Advanced Microscopy Group (Fisher Scientific, Питсбърг, Пенсилвания). За последователност едно и също лице извърши всички измервания. Изображение J (Версия 1.48, Национален здравен институт) се използва за определяне на площта на адипоцитите (μm 2), като се използват настройки на микроскопа от 2,8 μm/пиксел и се използва ограничението, че измерванията трябва да надвишават 500 μm 2. Разпределенията на честотата бяха получени чрез групиране на адипоцитите в кошчета въз основа на площта и преброяване на честотата на клетките във всеки контейнер. Използван е стандартен метод за изчисляване на обема на адипоцитите и числото 68 .

PCR анализ в реално време

Общата РНК се изолира от приблизително 200 mg коремна мастна тъкан и черен дроб от пет пилета на 14 d във всяка диетична група, използвайки Invitrogen TM TRIzol TM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Използвани са петте птици със стойности на затлъстяване, най-близки до средната затлъстяване във всяка диета. CDNA се синтезира от 500 ng обща РНК в 20 μl реакции, използвайки iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Предварително проектирани и валидирани праймери за количествена PCR в реално време (QPCR) са закупени от Qiagen (Quantitect; Germantown, MD). QPCR се извършва в три екземпляра за всяка проба, като се използва iQ SYBR Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), както е описано по-горе 53. Нивата на експресия на гените, които представляват интерес, бяха нормализирани спрямо експресията на TBC1 семейство домейни, член 8 (TBC1D8) използва се като икономка.

Протеомика

Приблизително един g коремна мастна тъкан от всяко от трите пилета на диета се пулверизира в течен азот, от които приблизително 60 mg се използват за екстракция на протеини. Протеините се екстрахират с помощта на протокол за екстракция на протеин без метан/хлороформ (2: 1) без детергент, предназначен за богати на липиди тъкани и въз основа на метода Bligh and Dyer 70 Протеините се утаяват от водната фракция, като се използва трихлороцетна киселина и се усвояват с трипсин за секвениране. Приблизително два mg протеолитични пептиди са получени от всяка проба след почистване. Петдесет ug аликвотни части от тези пептиди бяха използвани за 2D-LC-MS/MS протеомични измервания на LTQ Orbitrap масспектрометър (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), както е описано по-горе 71. MyriMatch v2.1.111 72 е бил използван за търсене на суровите мас спектри спрямо прогнозираната база данни за протеини, за да се идентифицират напълно триптични пептиди, които след това са били групирани заедно в съответни протеини с IDPicker v.3 73. За по-нататъшен анализ бяха взети предвид само протеинови идентификации с поне два идентифицирани пептидни спектъра и максимална q-стойност от 0,02. Пептидните фрагменти са картографирани с протеини в Gallus gallus геном (V3.0), използвайки Uniprot.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SAS (V 9.4). Данните бяха проверени за нормалност с помощта на Shapiro-Wilks преди статистически тестове. Теглото на тялото и мастната тъкан, серумните метаболити, съставът на мастните киселини в тъканите, средният размер на адипоцитите и броят на адипоцитите бяха анализирани, използвайки смесен модел ANOVA с термини за диета, възраст и тяхното взаимодействие (диета X възраст). Значителни F-тестове (P 74 за нормализиране на разпределението на данните. Извършен е функционален анализ на диференциално изобилни протеини, използвайки опциите за функционално анотиране и картографиране на пътя, намерени в базата данни за анотации, визуализация и интегрирано откриване (DAVID, V 6.8) 75. Всички статистически тестове са извършени с помощта на P-стойности ≤ 0,05 като критерий за статистическа значимост.

Наличност на данни

Наборите от данни, генерирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка