От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

инсулт

От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

От отделите по нефрология (ELAB, MS, HAK, JAJ) и експериментална неврология (PRDB) и патология (GHJ), Университетска болница Утрехт и отдел на In Vivo NMR, център Bijvoet, Университет Утрехт (ELAB, KN), Утрехт, Холандия.

Резюме

Предистория и цел—Спонтанно хипертонични плъхове, подложени на инсулт (SHRSP), подложени на висок прием на натрий, развиват тежка хипертония, мозъчен оток и протеинурия, завършващи с увреждане на органи и ранна смърт. ЯМР, който може да се прилага последователно, предоставя уникалната възможност за изследване на времевите и количествени връзки между тези промени и дали намаляването на приема на натрий може да отслаби установения мозъчен оток.

Методи—SHRSP бяха подложени на 1% NaCl в питейна вода. Церебралната ЯМР, протеинурия и систолично кръвно налягане (SBP) бяха измервани серийно. След откриване на мозъчен оток (Т2-претеглена ЯМР), 6 плъха бяха убити за хистология, за да се потвърди диагнозата на мозъчен оток. Останалите са проследени още 7 дни, докато натоварването със сол е продължено (n = 10, група 1) или след нормализиране на приема на натрий (n = 7, група 2).

Резултати—SHRSP неизменно развива мозъчен оток за 30 дни (диапазон от 8 до 54 дни). Към този момент неврологичните признаци липсват при 16 от 23 плъхове. SBP нараства до 1 седмица преди откриване на мозъчен оток и след това се стабилизира при приблизително 265 mm Hg. Протеинурията неизменно предшестваше мозъчен оток, с концентрация над 40 mg/d, предсказваща развитие на мозъчен оток за 9 дни (диапазон от 3 до 15 дни). Имаше линейна корелация (R= .62, P 1 2 и появата на инсулт. 3 4 5 Диетичното ограничение на солта намалява риска и смъртността от инсулт. 6 SHRSP е експериментален модел на злокачествена хипертония и има висока честота (80%) на мозъчно-съдови заболявания. 7 Повишаването на приема на натрий от 8-седмична възраст нататък ускорява повишаването на кръвното налягане и появата на церебрален вазогенен оток при SHRSP. 8 По този начин младият SHRSP е подходящ модел за изследване на свързано с приема на натрий развитие на злокачествена хипертония и мозъчно-съдова болест. 7 8 В допълнение към мозъчния вазогенен оток, SHRSP развива протеинурия, 7 8 която е призната за важен прогностичен маркер за появата на инсулт. 9

Материали и методи

Животни

Мъжки SHRSP (n = 23), на възраст 6 седмици, са получени от IFFA Credo, L’Arbresle, Франция. Те бяха настанени в постоянни условия (ден/нощ: 12/12; влажност, 55%; температура, 22 ° C), като им беше предоставен свободен достъп до стандартна чау-чау (RMH-TM чау-чау: протеини 22,2%; мазнини 4,8%; калий 0,85%; натрий 0,40%; Hope-Farms) и разрешена вода ad libitum. Протоколът е одобрен от борда на университета в Утрехт за изследване върху опитни животни.

Протокол

Измерванията на изходното ниво бяха събрани при всички плъхове на възраст 7 седмици, за да се определи стандартизираният праг на мозъчен оток при всеки отделен плъх (вж. По-долу). Впоследствие на възраст от 8 седмици всички плъхове са преминали на висок прием на сол с 1% NaCl (170 mmol/L) в питейна вода, за да ускорят появата на мозъчен оток. 8 Плъховете са наблюдавани ежедневно за явни неврологични симптоми и са били подлагани на седмични измервания на кръвното налягане, T2W MRI на мозъка и метаболитни изследвания, като последните са оценявали приема на натрий, бъбречната функция и протеинурията (вж. По-долу). Това продължи до откриването на церебрални аномалии с T2W MRI (дефиниран като ден 0). Ако плъх показва поведенческа дисфункция, интеркурентното изобразяване се извършва незабавно.

След появата на първите им аномалии при T2W MRI, плъховете бяха рандомизирани в три групи. Шест плъха бяха убити поради патология, за да се оцени естеството на промените в ЯМР (група 0). Тези плъхове не са включени в количествения анализ на данните. Група 1 (n = 10) продължи високия прием на сол, а група 2 (n = 7) премина към нормален прием на сол. Групи 1 и 2 бяха подложени на T2W MRI на 3 и 7 ден и на метаболитни изследвания на 6 ден. След 7 дни тези плъхове бяха подложени на патологично изследване в подкрепа на интерпретацията на MRI данните.

Бъбречна функция и кръвно налягане

За седмичните метаболитни изследвания плъховете се претеглят, след което се настаняват индивидуално в метаболитни клетки в продължение на 24 часа. По време на тези измервания се измерва приемът на храна и вода и се събира урина. Определят се обемът на урината и концентрациите на натрий, креатинин и протеин. За да се определи плазменият креатинин, кръвта от опашната артерия се събира в хепарин преди ядрено-магнитен резонанс и веднага се центрофугира в продължение на 10 минути при 3000ж. Протеинът в урината се определя с метода на Брадфорд. Креатининът в плазмата и урината се определя калориметрично. Систоличното кръвно налягане се измерва ежеседмично чрез плетизмография с маншет (IITC) при плъхове в съзнание след предварително затопляне при температура на околната среда 37 ° C.

Хистология

Непосредствено след последната сесия на ЯМР на 7-ми ден, сандъците на анестезираните животни бяха отворени и в лявата камера на сърцето беше поставена перфузионна канюла за перфузия. Извършено е измиване с изотоничен хепаринизиран (270 IU/kg) физиологичен разтвор (2 до 3 минути) и веднага последвано от перфузионно фиксиране с 4% формалдехид в 0,1 mmol/L фосфатен буфер при налягане, две трети от това на последното измерено систолично кръвно налягане по метода на плетизмографията на маншета на опашката. Десет μm участъци от мозъка (10 участъка на интервали от 500 μm) бяха оцветени с хематоксилин/еозин и луксол бързо синьо. Мозъци на плъхове, които са умрели спонтанно, са събрани във формалдехид за хистология.

T2W ЯМР

След предизвикване на анестезия с 1% халотан в N2O/O2 (70/30), плъховете бяха интубирани и механично проветрени по време на сеанса за ЯМР със същата смес. Издишваният CO2 се наблюдава и телесната температура се поддържа на 37 ° C с помощта на загрята водна подложка. За да се предотврати движение, плъховете бяха закрепени в стереотаксичен държач и разположени в 4.7-T, 200- до 400-NMR спектрометър (SIS Co). За предаване и приемане на сигнал е използвана 120-мм намотка Helmholtz. След сагитално скаутско изображение, коронален многослоен спин-ехо T2W MRI, покриващ целия мозък (25 среза от 1 mm; TE/TR, 60/3000; матрица, 128 × 128; зрително поле, 40 × 40 mm; два прехода ) е извършен.

T2W MRI оценка

Мозъкът е сегментиран от околното изображение чрез автоконтуриране, анализ, който автоматично генерира контури чрез проследяване на ръбове върху двоична маска, зададена от горния и долния праг на стойностите на интензивността. От всяко животно се събира изходен SIIS преди зареждане със сол. В този SIIS 25 коронални T2W изображения (40 × 40 × 1 mm) рострално от малкия мозък са събрани по такъв начин, че ростралната/опашната, лявата/дясната и гръбначната/вентралната оси на мозъка са разположени успоредно на z, x, и у оси на магнита на ЯМР спектрометъра, съответно. Четирите резена, каудални до линията на малкия и малкия мозък, се считат за референтна област, където отокът никога не е възникнал (REFerence area). Това беше потвърдено (вж. „Резултати“). Останалата част от мозъчния рострал до тази линия до последния парче с кортикална област беше анализирана за появата на мозъчен оток. От тази мозъчна област и от референтната област е изчислена средната интензивност (mi) на пикселите (стр МОЗЪК SIIS ми и стр REF SIIS ми, съответно). Стандартното отклонение (ς) на базовата линия стр BRAIN SIIS mi също беше изчислен.

Стандартизираният праг, стр BRAIN стандартизиран праг на оток в мозъка е уникален за отделно животно и се определя като:

Статистика

Данните бяха оценени чрез двупосочен ANOVA за повторни измервания, последвани от двойна процедура за многократно сравнение (метод Student-Newman-Keuls). Данните са представени като средно ± SEM. P 17). Оттам отокът неизменно прогресира до ипсилатералното бяло вещество. В някои случаи отокът се разпространява през мозолистото тяло до контралатералното бяло вещество. Отокът никога не се наблюдава в малкия мозък. В места с вазогенен оток от време на време се появяват вторични хеморагични петна.

Фигура 3 показва процента едематозни пиксели в главния мозък, който обхваща 13 до 14 филийки, и включва тези резени рострално до линията на малкия мозък/мозъка до първия резен без кортикална област. Отокът се определя при всеки плъх по отношение на индивидуален праг, дефиниран като среден интензитет на пикселите ± два пъти стандартното отклонение в изходното ниво. Следователно 5% от пикселите са извън този диапазон, по дефиниция 2,5% над и 2,5% под този диапазон. Следователно пикселите над този диапазон са (по дефиниция) „едематозни“ в начална линия. На ден 0, 5,8 ± 1,1% от пикселите в изследваната част на мозъка на плъховете от група 1 и 4,9 ± 0,5% от пикселите при плъховете от група 2 бяха оточни. Тези числа не се различават, но и двете се различават значително от предходните времеви точки (ден -3 и изходно ниво; P 12 18 Използвайки последователни мозъчни изображения, успяхме да определим количествено оток като увеличаване на интензивността на пикселите по отношение на дефинирания базов праг. При SHRSP, мястото и размерът на първичната и вторичната лезия са променливи и често се разпространяват от предимно засегнатата страна на главния мозък към контралатералната страна. Следователно трябваше да свържем интензивността на пикселите в мозъка с интензивността на пикселите в референтна област извън главния мозък. При хипертоничните плъхове малкият мозък винаги е без отоци. 7 19 Това беше потвърдено в настоящото проучване, утвърждавайки използването на тази област като референция. Използването на тази референтна област също позволи корекция за вариабилност между изображенията. Този подход ни позволи да анализираме количествено прогресията и регресията на мозъчния оток, осигурявайки мощна техника за бъдещи изследвания.

SHRSP развива мозъчен оток на възраст около три месеца, което е средно 30 дни (диапазон: от 8 до 54) след началото на натоварването със сол. Лезиите на T2W MRI се характеризират с хиперинтензивни пиксели в резултат на удължаване на T2. Удължаването на Т2, чувствителен ЯМР индикатор за мозъчно увреждане, е свързано с отоци. 12 16 20 Понякога хиперинтензивните пиксели се комбинират с хипоинтензивни пиксели, като последният е резултат от редукция на Т2, което показва кръвоизлив. Намаляването на Т2 е в съответствие с парамагнитните ефекти на дезоксихемоглобина. 21 Обширният мозъчен кръвоизлив в ден 0 е необичаен (3/23 плъхове). По-късно понякога се появява кръвоизлив, както в първоначално засегнатата област, така и в по-скоро засегнатите райони.

Докато плъховете са били на диета с високо съдържание на сол, мозъчният оток корелира добре с протеинурията, посочвайки паралелна вариация в пропускливостта на мозъчната васкулатура и бъбречните гломерулни капиляри. Разбира се, това не означава причинно-следствена връзка между протеинурията и мозъчния оток. Всъщност, стабилизирането на мозъчния оток, поради нормализиране на приема на натрий, беше придружено от значително намаляване на протеинурията. Вероятно, след като приемът на натрий се нормализира, SHRSP е в състояние да постигне натриев баланс с възстановяване на прегломеруларното съдово съпротивление. Поддържането на прегломеруларна съдова резистентност предотвратява гломерулната хипертония 33, а гломерулната хипертония е предпоставка за протеинурия при хипертонична бъбречна болест. 34

В заключение, идентифицирането на мозъчния оток чрез многократно извършване на T2W ЯМР при натоварен със сол SHRSP разкри, че в този модел протеинурията неизменно предшества мозъчния оток и че мозъчният оток често предшества неврологичните симптоми. Количествената оценка на процента на големия мозък, който съдържа оток, ни позволи да свържем мозъчния оток с протеинурия. В допълнение, нормализирането на приема на натрий предотвратява прогресията на мозъчния оток и намалява протеинурията. Тези ефекти, които не се дължат на намаляване на кръвното налягане, могат да бъдат свързани с възстановяване на обема на извънклетъчната течност, така че в главния мозък екстравазацията на течност през увредената кръвно-мозъчна бариера да се балансира чрез отстраняване и в бъбречната гломерулна капилярна налягането се нормализира чрез възстановяване на съдовото съпротивление нагоре по веригата. Тези механистични хипотези очакват допълнително проучване.