• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за António Galvão
  • За кореспонденция: Antonio.Galvao @ babraham.ac.uka.galvao @ pan.olsztyn.plGavin.Kelsey @ babraham.ac.uk

РЕЗЮМЕ

Предистория/Цели Затлъстяването е свързано с безплодие, намалено представяне на яйчниците и липотоксичност. Въпреки това, малко е известно за етиологията на тези репродуктивни увреждания. Тук ние предполагаме, че по-голямата част от промените във физиологията на яйчниците при индуцирано от диетата затлъстяване (DIO) са следствие от промени в транскрипцията след променената сигнализация на лептина. Следователно, ние изследвахме степента, до която сигнализацията за лептин се променя в яйчника при затлъстяване, с особен акцент върху ефектите върху кумулусните клетки (CCs), интимните функционални спътници на яйцеклетката. Освен това използвахме фармакологичния хиперлептинемичен (LEPT) модел на мишка, за да сравним транскрипционните профили с DIO.

затлъстели

Методи Мишките бяха подложени на DIO в продължение на 4 и 16 седмици (седмица) и лечение с лептин в продължение на 16 дни, за да се изследват ефектите в яйчниците в компонентите на лептиновата сигнализация на нивата на транскрипта и протеина, като се използва Western blot, PCR в реално време и имунооцветяване. Освен това използвахме нискоклетъчно РНК секвениране, за да характеризираме промените в транскриптома на CC в тези модели.

Резултати В модела DIO затлъстяването доведе до установяване на устойчивост на яйчников лептин след 16-седмична диета с високо съдържание на мазнини (HFD), както се доказва от повишаване на регулатора на обратна връзка супресор на цитокиновата сигнализация 3 (SOCS3) и намаляване на положителните ефектори фосфорилиране на тирозин 985 на лептинов рецептор (ObRb-pTyr985) и Janus киназа 2 (pJAK2). Анализът на транскриптом на CCs разкрива сложен отговор на DIO, с голям брой и различни набори от гени, дерегулирани в ранните и късните етапи на затлъстяването; в допълнение, имаше поразителна корелация между телесното тегло и глобалния профил на транскриптома на CC. Допълнителен анализ показа, че профилът на транскриптома в 4 седмици HFD CCs прилича на този на LEPT CCs, при повишаване на регулацията на клетъчния трафик и увреждане в организацията на цитоскелета. Обратно, след 16 седмици CC HFD показват промени в експресията, показателни за увеличени възпалителни реакции, клетъчна морфогенеза и намален метаболизъм и транспорт, главно като последица от физиологичните промени на затлъстяването.

Заключение Затлъстяването води до яйчникова лептинова резистентност и големи зависими от времето промени в генната експресия в CCs, които в началото на затлъстяването могат да бъдат причинени от повишена лептинова сигнализация в яйчниците, докато в края на затлъстяването вероятно е следствие от метаболитни промени, протичащи в пълна майка.

ВЪВЕДЕНИЕ

Затлъстяването се счита за едно от основните предизвикателства за общественото здраве в съвременността и е свързано с различни съпътстващи заболявания, като метаболитен синдром, диабет тип 2, рак, инсулт (1) и безплодие (2). Затлъстелите жени имат повишен риск от менструални дисфункции и ановулация, усложнения при бременност и лош репродуктивен резултат (3). При модели на мишки затлъстяването се характеризира с натрупване на липиди в яйчниците и произтичаща липотоксичност (4) и оксидативен стрес (5). Независимо от това, точните механизми, лежащи в основата на патогенезата на яйчниците в хода на затлъстяването, остават нехарактерни.

Към днешна дата се знае малко за целостта на сигнала за лептин в яйчника по време на прогресията на затлъстяването и неговото особено въздействие върху кумулусния оофорен комплекс (COC). Кумулусните клетки (CC) са жизненоважни регулатори на растежа и метаболизма на ооцитите (21), контролиращи възобновяването на мейозата (22), както и самия процес на овулация (23). По този начин, по-доброто познаване на патофизиологията на събитията, случващи се в тези клетки в хода на затлъстяването, ще ни позволи да разберем молекулярните механизми, водещи до нарушена работа на яйчниците и безплодие. Освен това, транскрипционният подпис на CC е бил използван за прогнозиране на компетентността на ооцитите или качеството на ембрионите (24,25), демонстрирайки важността на такива препратки в техниките за асистирана репродукция. Тук първо характеризираме установяването на лептинова резистентност в цели яйчници от диети, предизвикани от затлъстяване (DIO) мишки, хранени в продължение на 4 и 16 седмици (седмица). Впоследствие анализирахме транскриптома на CCs по време на прогресията на затлъстяването и идентифицирахме изменени във времето подписи на генната експресия. И накрая, използвайки миши модел за фармакологична хиперлептинемия (LEPT), ние точно определяме транскрипционните събития, медиирани от повишена лептинова сигнализация в CC в ранните стадии на затлъстяването.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Протокол за животни

Двойки за разплод от щамове мишки C57BL/6J (B6) и B6.Cg-Lep ob/J (ob/ob) са получени от лабораторията Jacksons (The Jacksons Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA). На 8 седмици на възраст B6 животните бяха разделени на 2 групи (n = 12/група). В DIO контролната група е хранена с диета ad libitum chow (CD, 11% енергия в kcal от мазнини, 5053, диета за гризачи 20, LabDiet IPS, Лондон, Великобритания), докато експерименталната група е получавала диета с високо съдържание на мазнини (HFD, 58% енергия в kcal от мазнини, AIN-76A 9G03, LabDiet IPS). Мишките се поддържат на съответната диета в продължение на 4 или 16 седмици. По отношение на фармакологичния протокол за хиперлептинемия, 8 седмици стари B6 женски мишки, хранени с CD, бяха разделени на две групи (n = 15/група): i) физиологичен разтвор 16 дни (d) (CONT); ii) лептин 16 d (Рекомбинантен миши лептин, GFM26, Cell Guidance Systems, Cambridge, UK). Животните се инжектират интраперитонеално два пъти дневно, в 09:00 ч. И 21:00 ч. И се прилага обща доза от 100 μg/ден лептин. Що се отнася до ob/ob модела, мишките не бяха отбити до дванадесет седмици на CD. За всички протоколи мишките бяха настанени с 12 h светъл/12 h тъмен цикъл при стайна температура (23 □, RT).

За фенотипна характеристика на DIO, промените в телесния състав се наблюдават на всеки 4 седмици чрез ядрено-магнитен резонанс (NMR, Bruker, Rheinstetten, Германия), докато в модела LEPT животните се фенотипират на всеки три дни. Измерва се телесно тегло (BW), мастна маса (FM), чиста маса (LM), индекс на затлъстяване (AI, маслена маса/чиста маса) и прием на храна (FI). За модели DIO и LEPT вагиналната цитология е направена в 9:00 ч, дванадесет последователни дни. След вагинална промивка с физиологичен разтвор, цитонамазките се поставят върху чисти стъклени стъкла и се оцветяват с Diff Quick Staining Set (Diff-Quick Color Kit, Rapid Staining Set, Medion Grifols Diagnostics AG, Duedingen, Switzerland), за идентифициране на клетки, както е описано по-горе (26 ). Резултатите бяха анализирани за процент от времето, прекарано в естрозен етап (допълнително обяснено на фигура добавка 1J, 1K; фигура добавка 6G). Всички проби за иРНК, анализ на протеини и оцветяване са събрани на етапа на еструса.