Резюме

  • AR, андрогенен рецептор
  • GTT, тест за глюкозен толеранс
  • ITT, тест за толерантност към инсулин
  • PI3K, фосфоинозитид-3-ОН киназа
  • PPAR, рецептор, активиран от пероксизомен пролифератор
  • TNF-α, фактор на туморна некроза-α
  • WAT, бяла мастна тъкан

Смята се, че до 2030 г. в света ще има 366 милиона души, засегнати от диабет тип 2 (1), като много от засегнатите ще бъдат във възрастовата група в напреднала възраст (2). Въпреки че основните фактори, причиняващи това заболяване, са неуловими, ясно е, че инсулиновата резистентност и нечувствителността към лептин могат да играят основна роля в развитието му (3).

мишки

Епидемиологичните данни показват, че при диабет тип 2 съществуват полови разлики. Разпространението на диабет тип 2 е по-високо при мъжете, отколкото при жените (1), вероятно поради разликите в чувствителността към инсулин и регионалното отлагане на мазнини в тялото (4,5). Подробните механизми за това как половите хормони влияят върху инсулиновата чувствителност или отлагането на мазнини обаче остават неясни. Тестостеронът и неговият метаболит, дихидротестостерон, могат да активират андрогенните рецептори (AR), за да упражняват своите андрогенни действия. Правилното или максимално действие на андрогена може да изисква взаимодействие със селективни корегулатори в селективните тъкани (6,7).

Доказано е, че лептинът, произведен от адипоцити адипокинов продукт на гена ob, предизвиква отрицателен енергиен баланс чрез намаляване на апетита и увеличаване на енергийните разходи (8). Лептинът циркулира в серума на нива, паралелни на масата на телесните мазнини. Установено е обаче, че хората със затлъстяване са устойчиви на отрицателната регулаторна функция на циркулиращия лептин (9). Ob/ob и db/db мишки, при които липсва лептин или са съответно резистентни към лептин, са дълбоко хиперфагични и хипометаболични, което води до затлъстял фенотип и проявяват множество аномалии, като диабет тип 2 с тежка инсулинова резистентност, хипотермия и непоносимост към студ, безплодие и намаляване на чистата маса (10–14).

Към днешна дата обаче връзката между андроген-AR и чувствителността към инсулин остава неясна и малко се знае за ролята на андроген-AR в свързаните с възрастта промени за регулиране на производството на лептин. Следователно, ние използвахме условна нокаут стратегия за генериране на AR нокаутиращи мишки (AR -/y), за да проучим тази връзка (15) и тук докладваме влиянието на загубата на AR върху инсулинова и лептинова резистентност.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Всички процедури за животни са одобрени от комитета по грижа и употреба на животните към Медицинския факултет на Университета в Рочестър, в съответствие с насоките на Националните здравни институти. Изграждането на насочващи вектори и генерирането на мишки основатели на химера са описани по-рано (15). Щамовете на мишките основатели на мозайка са C57BL/6 и 129Sv фон. β-актинът е домакински ген и е универсално експресиран във всяка тъкан; следователно, задвижваният от β-актинов промотор Cre (ACTB-Cre; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ще експресира и изтрива флоксирани AR фрагменти във всички тъкани. AR -/y мишките бяха генотипирани чрез PCR, както е описано по-горе (15). Животните бяха настанени в съоръжения, свободни от патогени, поддържани по 12-часов график светлина/тъмнина (светлина в 06:00) и имаха свободен достъп до стандартна лабораторна чау (№ 5010; PMI Lab Diet, Сейнт Луис, Мисури) и вода.

Хистология.

Тъканите бяха фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин и вградени в парафин. Несъседните участъци, разделени с 70–80 μm, бяха получени от перигонадни мастни накладки и анализирани систематично по отношение на размера и броя на адипоцитите. Оцветяването на срезовете се извършва с хематоксилин/еозин. Изображенията са получени с помощта на микроскоп E800 (Nikon, Melville, NY) и SPOT камера (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI) и са анализирани с помощта на софтуера SigmaScan Pro (версия 5.0; SPSS, Чикаго, Илинойс).

Аналитични процедури.

Активност на фосфоинозитид-3-ОН киназа.

Мишките се подлагат на 14-часова бърза инжекция с физиологичен разтвор или инсулин (10 единици/kg телесно тегло i.p.) и се умъртвяват 3 минути след инжектирането. Тъканите бяха събрани и замразени. Активността на фосфоинозитид-3-ОН киназата (PI3K) беше измерена във фосфотирозинови имунопреципитати (p-Tyr, Ab-4; EMD Biosciences, Сан Диего, Калифорния) от бяла мастна тъкан (WAT), скелетни мускули и чернодробни лизати, както е описано по-рано (16).

Интраперитонеално приложение на лептин.

Мишките бяха разделени на две групи и бяха третирани веднъж дневно с еднакви обеми интраперитонеално инжектиран физиологичен разтвор или миши лептин (R&D Systems, Minneapolis, MN), разтворен във физиологичен разтвор в дози от 5 μg/g телесно тегло в продължение на 6 дни. Приемът на храна и промените в телесното тегло бяха измерени, за да се оценят ефектите от приложението на екзогенен лептин.

Количествена RT-PCR в реално време.

WAT на мишки, скелетни мускули и черен дроб от див тип и AR -/y се дисектират и се изолира обща РНК, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA синтез и PCR бяха извършени с помощта на Superscript RNase H - обратна транскриптаза и cDNA цикъл комплект (Invitrogen) в съответствие с инструкциите на производителя. PCR в реално време се извършва, като се използва iCycler PCR усилвател в реално време (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Всяка PCR съдържа 1 μl cDNA, 50 μmol/l праймери и 12,5 μl iQ SYBR Green Supermix реагент (Bio-Rad Laboratories) и се утроява и 18s се използва като вътрешен контрол. Списък на праймерните последователности за PCR в реално време е наличен в Таблица 1.

Проучване за заместване на дихидротестостерон.

60-дневно освобождаване на 5α-дихидротестостерон (5 mg) или плацебо гранули (Innovative Research of America, Sarasota, FL) се поставя в подкожния джоб (задната част на врата) на мъжки мишки от див тип и AR -/y, съответно. На 8 седмици след имплантирането на пелетите, мишките бяха убити, за да изследват серумните хормони и метаболитните параметри.

статистически анализи.

Развитие на инсулинова резистентност при AR -/y мишки.

Като се има предвид излишното отлагане на липиди в WAT, ние изследвахме нивата на кръвната глюкоза и инсулин при мъжки мишки от див тип, жени от див тип и AR -/y. AR -/y мишките започват да показват повишена кръвна глюкоза на 20 седмици (Таблица 3), която продължава поне 35 седмици както на гладно, така и на хранене (Таблица 2). Хипергликемията се е появила въпреки забележимо повишаване на серумните нива на инсулин на гладно (∼60%) и хранене (∼67%), което показва, че AR -/y мишките са по-устойчиви на инсулин от техните аналози от див тип при околни условия ( Таблица 2).

За да се оцени хомеостазата на глюкозата в цялото тяло, ние след това извършихме орални болусни GTT и интраперитонеални ITT на тези мишки. Оралните болусни GTT демонстрират изразена непоносимост към глюкоза и различима площ под кривата при AR -/y мишки (Фиг. 2А и В). Нивата на глюкоза в кръвта на AR -/y мишки са били по-високи през цялото време на теста и хипергликемията все още е била очевидна 2 часа след глюкозния болус. ITTs показаха, че AR -/y мишките са слабо устойчиви и силно устойчиви на хипогликемичния ефект на екзогенен инсулин на възраст съответно на 25 и 35 седмици (Фигури 2С и D). Дефектът в инсулиновата чувствителност на цялото тяло не е причинен от фенотип, подобен на женски при AR -/y мишки, тъй като не открихме разлики в моделите на реакция на мишки от див и мъжки тип.

Тъй като инсулиновата резистентност може да бъде свързана с активността на PI3K, сигнален медиатор, необходим за много метаболитни ефекти на инсулина, ние изследвахме стимулирана от инсулин PI3K активност, използвайки мишки от див тип като контроли. Активността на PI3K при инсулинова стимулация при AR -/y мишки е намалена с 60–63% в инсулиновите целеви органи, като скелетни мускули и черен дроб (фиг. 2E), което предполага, че AR -/y мишките са имали скелетни мускули и чернодробен инсулин резистентност и хиперинсулинемия със затлъстяване.

Повишено отлагане на липиди и нива на лептин при AR -/y мишки.

Нивата на серумни свободни мастни киселини на гладно са повишени при AR -/y мишки (Таблица 2). Нещо повече, съдържанието на скелетни мускули и чернодробни триглицериди значително се е увеличило съответно с 2,6 и 1,9 пъти, което показва, че инсулиновата резистентност е свързана с нарастващо отлагане на триглицериди в скелетните мускули и черния дроб (фиг. 2F). Както се очаква от увеличената маса на WAT, хранените серумни концентрации на лептин са по-високи при AR -/y мишки както на 25, така и на 35 седмична възраст (Фиг. 3А). Нещо повече, серумните нива на лептин показват повишени линейни връзки с телесното тегло при AR -/y мишки в сравнение с дивите тинейджъри (фиг. 3В). Изненадващо, хранените серумни нива на лептин също са по-високи, въпреки че AR -/y мишките са натрупали значително по-малко тегло преди 20-седмична възраст (Фиг. 3А), което показва, че загубата на AR може да причини повишен лептин по-рано от увеличеното телесно тегло. Адипонектинът, инсулин-сенсибилизиращ адипокин, беше намален при AR -/y мишки (фиг. 3С), докато нямаше разлика в нивата на TNF-α (фиг. 3D).

Развитие на лептинова резистентност при AR -/y мишки.

Също така установихме, че приемът на храна и телесното тегло са значително намалени след екзогенно прилагане на лептин при мишки от див тип, но не и при AR -/y мишки (Фиг. 4А и В). Освен това приемът на храна не се различава значително при AR -/y мишки в сравнение с див тип мишки преди приложението на екзогенен лептин, въпреки повишените нива на лептин, което показва, че AR -/y мишките са били устойчиви на лептин на възраст 35 седмици. Приемът на храна и телесното тегло обаче са намалени след екзогенно натоварване с лептин както при 20-седмични AR -/y мишки, така и при мишки от див тип, докато две контролни групи имат сходно телесно тегло и затлъстяване (Фиг. 4С и D) . Тези резултати предполагат, че AR -/y мишки развиват резистентност към лептин, което може да бъде причинено от развитието на затлъстяване и дългосрочното отсъствие на AR.

Загубата на AR промени липидните метаболитни профили.

За да се определи механизмът на увеличеното отлагане на липиди в WAT, както и натрупването на скелетни мускули и чернодробни триглицериди, иРНК от тези тъкани бяха допълнително анализирани. Нивата на mRNA на четири гена за липиден метаболизъм, активиран от пероксизомен пролифератор рецептор (PPAR) -γ (PPARγ), CCAAT/енхансер-свързващ протеин-α (C/EBPα), адипоцитен протеин, свързващ мастни киселини/адипоцит P2 (aP2), и стерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1c (SREBP1c), са били по-високи в WAT на AR -/y в сравнение с мишки от див тип (Таблица 4), което предполага, че загубата на AR може да допринесе за увеличаване на адипогенезата и липогенезата чрез стимулиране на няколко гени. Освен това, в съответствие с натрупването на триглицериди, загубата на AR намалява нивата на иРНК на PPAR-α (PPARα) в скелетните мускули и черния дроб (Таблица 4). Тези резултати предполагат, че AR е пряко или непряко участва в липидния метаболизъм.

Заместването с дихидротестостерон не успява да обърне метаболитните аномалии и инсулиновата резистентност при AR -/y мишки.

Тъй като серумните нива на тестостерон са значително намалени в резултат на атрофични тестиси при AR -/y мишки, не можем да изключим възможността инсулиновата резистентност и метаболитните аномалии при AR -/y мишки просто да отразяват ниските нива на андрогени. За да се обърне внимание на този проблем, неароматизируемият андроген, дихидротестостерон, се дава както на 26-, така и на 12-седмични AR -/y, както и на диви типове. Няколко серумни хормона и метаболитни параметри бяха оценени след 8 седмици имплантиране на пелети. Заместването с дихидротестостерон възстановява нивата на серумния дихидротестостерон до физиологичния диапазон (0,6–0,9 ng/ml) при AR -/y мишки. Известно е, че естрадиолът се превръща не само от естрон, но и тестостерон; следователно не бихме могли да изключим възможността аномалиите при AR -/y мишки просто да отразяват по-малко естроген, преобразуван от тестостерон, въпреки че установихме, че серумните нива на естрадиол, както и нивата на прохормона андростендион, остават непроменени при AR -/y мишки в сравнение с мишки от див тип (таблици 3 и 5). Заместването с дихидротестостерон не може да обърне метаболитните аномалии и инсулиновата резистентност при AR -/y мишки в нито една възрастова проучвателна група (таблици 3 и 5), което предполага, че андрогенните действия, пряко медиирани чрез AR, са значими за инсулиновата чувствителност.

ДИСКУСИЯ

Насечените епидемиологични проучвания показват пряка връзка между серумните концентрации на тестостерон и инсулиновата чувствителност (19). Ниските нива на тестостерон са свързани с повишен риск от диабет тип 2 при мъжете (20,21). Тъй като повечето андрогени трябва да се свържат с AR, за да упражняват своите андрогенни биологични функции, се смята, че AR функционира като модулатор на инсулиновата чувствителност. Нашите текущи резултати показват, че мишките, които нямат AR, развиват резистентност към инсулин и лептин в напреднала възраст. Съобщава се, че късното настъпване на затлъстяването, както наблюдаваме при AR -/y мишки, е свързано с инсулинова резистентност (22). Маркираната хиперинсулинемия и хипергликемия при AR -/y мишки ясно показват, че загубата на AR може да намали инсулиновата чувствителност. Сравнително малко увеличение на телесното тегло (~ 15%) се свързва със забележително намаляване на инсулиновата чувствителност (~ 65%) при AR -/y мишки и с инсулинова резистентност, която се проявява още на 20-седмична възраст при неносебни AR -/y мишки, което предполага, че загубата на AR може директно да намали инсулиновата чувствителност в прицелните тъкани, без първо да увеличи значително телесното тегло.

Фенотипно женският външен вид на AR -/y мишки е подобен на този на Tfm (тестикуларни феминизирани) мишки, при които AR е функционално дефицитен чрез въвеждане на Tfm мутация в AR гена (23). Следователно, ние добавихме женски мишки от див тип за сравнение и тези мишки остават по-малки и имат по-малко мазнини от мъжки мишки от див тип и AR -/y. В допълнение, ние не открихме значително различим метаболитен модел между женски и мъжки мишки от див тип, докато AR -/y мишки показаха тежка инсулинова резистентност и затлъстяване. Предишно проучване показа, че мъжете db/db Tfm/Y развиват тежък диабет. За разлика от това, женските db/db littermates показват само лека хипергликемия (24).

Интересното е, че заедно със загубата на AR, за която демонстрирахме в резултат метаболитен синдром, както загубата на естрогенен рецептор-α (48), така и дефицитът на ароматаза, което причинява загуба на способността да синтезира естроген (49), водят до метаболитни синдроми. Тези наблюдения показват възможността загубата на реакция на андроген и естроген да наруши енергийната хомеостаза.

В обобщение, AR -/y мишки предоставят in vivo модел, показващ, че загубата на AR увеличава серумната концентрация на лептин и съдържанието на скелетните мускули/чернодробните триглицериди, което може да доведе до развитие на затлъстяване, лептинова резистентност и инсулинова резистентност. Тъй като затлъстяването и прогресивната инсулинова резистентност могат да доведат до диабет тип 2 и повишен риск от сърдечно-съдови заболявания (50), по-доброто разбиране на участващите молекулярни механизми и дисекция на ролите на андроген-AR в инсулиновата и лептиновата резистентност може да помогне за развитието на по-добри терапевтични подходи за диабет тип 2, затлъстяване и сърдечно-съдови заболявания.