Принадлежност Медицински институт Хауърд Хюз, Лаборатория по молекулярна генетика, Университета Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

развитието

Принадлежност Медицински институт Хауърд Хюз, Лаборатория по молекулярна генетика, Университета Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Принадлежност Медицински институт Хауърд Хюз, Лаборатория по молекулярна генетика, Университета Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Афилиация Медицински институт Хауърд Хюз, Лаборатория по молекулярна генетика, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

  • Захари А. Найт,
  • К. Шот Ханан,
  • Матю Л. Грийнбърг,
  • Джефри М. Фридман

Фигури

Резюме

Лептинът регулира телесното тегло, като сигнализира на мозъка за наличието на енергия, съхранявана като мазнина. Този цикъл на отрицателна обратна връзка се нарушава при повечето затлъстели индивиди, което води до състояние, известно като лептинова резистентност. Физиологичните причини за лептинова резистентност остават слабо разбрани. Тук тестваме хипотезата, че хиперлептинемията е необходима за развитието на лептинова резистентност при индуцирани от диета затлъстели мишки. Ние показваме, че мишките, чийто плазмен лептин е прикрепен към ниски нива, развиват затлъстяване в отговор на диета с високо съдържание на мазнини и големината на това затлъстяване не се различава от контрола от див тип. И все пак тези затлъстели животни с постоянно ниски нива на плазмен лептин остават силно чувствителни към екзогенен лептин дори след продължително излагане на диета с високо съдържание на мазнини. Това показва, че хранителните мазнини сами по себе си са недостатъчни, за да блокират отговора към лептина. Данните също така предполагат, че самата хиперлептинемия може да допринесе за лептинова резистентност чрез понижаване на клетъчния отговор на лептин, както е показано за други хормони.

Цитат: Knight ZA, Hannan KS, Greenberg ML, Friedman JM (2010) Хиперлептинемията е необходима за развитието на лептинова резистентност. PLoS ONE 5 (6): e11376. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011376

Редактор: Krisztian Stadler, Университет на Луизиана, Съединени американски щати

Получено: 30 март 2010 г .; Прието: 7 юни 2010 г .; Публикувано: 29 юни 2010 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от грантовете на NIH DK083531 (Z.A.K.) и DK041096 (J.M.F.). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Теглото на бозайниците се контролира от физиологична система, която балансира енергийния прием и разход в дългосрочен план [1]. Основният компонент на тази система, който сигнализира за наличието на телесни мазнини, е хормонът лептин [2]. Лептинът се секретира от адипоцитите пропорционално на техния размер и брой, така че концентрацията на лептин в кръвта е пропорционална на общото количество мастна тъкан [3], [4]. Свързването на лептин с неговите целеви неврони, които се експресират в хипоталамуса, мозъчния ствол и други мозъчни области, инхибира храненето и стимулира енергийните разходи. Следователно лептинът функционира като аферентния сигнал в отрицателна обратна връзка, която поддържа стабилно ниво на резервите от телесни мазнини.

Мишки с дефицит на лептин (ob/ob) и хората са с наднормено тегло и хиперфагия [5] и при тези индивиди заместителната терапия с лептин предизвиква драматична загуба на тегло [6], [7], [8], [9]. Повечето затлъстявания обаче са свързани с повишени плазмени нива на лептин [3], [4], което предполага резистентност към ефектите на лептина върху намаляването на теглото [10]. Приносът на лептиновата резистентност към затлъстяването също е установен от демонстрацията, че хиперлептинемичните животни и хората имат притъпен отговор на екзогенен лептин. Въпреки важността на очертаването на причините за лептиновата резистентност, отговорните клетъчни и молекулярни механизми остават слабо разбрани.

Диетата, предизвикана от затлъстяване, е добре характеризирана система за изследване на развитието на лептинова резистентност и патогенеза на затлъстяването. В този модел мишките C57Bl/6J, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (45% до 60% калории от мазнини), стават постепенно затлъстели и хиперлептинемични за период от 4 до 6 месеца. Тъй като тези животни стават затлъстели, те губят способността да намаляват приема на храна и телесното си тегло в отговор на лечението с лептин. В ранните стадии на затлъстяването мишките развиват резистентност към лептин, доставян периферно, но не централно; това се дължи на понижаване на регулацията или насищане на транспортната система, която транспортира лептин през кръвно-мозъчната бариера [11], [12]. След продължително излагане на диета с високо съдържание на мазнини (> 20 седмици), мишките стават устойчиви на лептин, дори когато той се влива директно в мозъка чрез мозъчната камера [10], [12], [13], [14]. При тези животни невроните, реагиращи на лептин от първи ред, очевидно са загубили способността да активират сигналните пътища надолу по веригата на лептиновия рецептор.

Как излагането на диета с високо съдържание на мазнини влошава лептиновата чувствителност на тези неврони? Предложени са два модела. Първият е, че лептиновата резистентност се причинява от повишени плазмени нива на лептин, които водят до хронична свръхстимулация на лептиновия рецептор и активиране на отрицателни обратни пътища, които блокират по-нататъшната лептинова сигнализация. Този модел се подкрепя от факта, че лептинът стимулира експресията на SOCS-3, протеин, който директно инхибира сигнала за лептин [15], [16], [17] и че аблация на SOCS-3 в невроните повишава чувствителността към лептин и защитава срещу затлъстяване, предизвикано от диета [18], [19], [20]. Освен това целенасочената експресия на конститутивно активна форма на STAT3, която е ключов медиатор на лептиновата сигнализация, е достатъчна, за да индуцира лептинова резистентност в хипоталамуса [21]. Този механизъм е аналогичен на намаляването на сигнализирането на инсулиновите рецептори, което е свързано с хронично лечение с инсулин и се смята, че е резултат от активирането на пътища за отрицателна обратна връзка, като сериново фосфорилиране на IRS-1 [22].

Алтернативно обяснение за развитието на лептинова резистентност е, че са отговорни диетичните мазнини, а не хиперлептинемията. Мазнините могат или да блокират директно сигнала за лептин, или да активират клетъчни процеси, като стрес и възпаление на ендоплазматичния ретикулум (ER), които увреждат реагиращите на лептин неврони [23], [24], [25], [26], [27], [28 ]. Този модел се подкрепя от факта, че е доказано, че фармакологичната или генетичната модулация на метаболизма на мазнините в хипоталамуса влияе върху енергийния баланс и чувствителността към лептин [26], [29], [30]. Освен това е известно, че лептиновата резистентност се развива най-силно в дъгообразното ядро ​​на хипоталамуса, което по отношение на други области на мозъка има подобрен достъп до циркулиращи хранителни вещества [13]. Освен това в някои [10], [31], но не във всички [32] се наблюдава експериментална настройка, че мишките, хранени с високо съдържание на мазнини, не консумират повече калории, отколкото мишките, хранени с ниско съдържание на мазнини; това предполага, че самата диетична мазнина, а не увеличеният енергиен прием, може да е отговорна за резистентността към лептин при тези животни.

За да разграничим тези две възможности, ние разделихме приноса на хиперлептинемията и хранителните мазнини за развитието на лептинова резистентност чрез (1) с помощта на осмотични инфузионни помпи за затягане на плазмения лептин на ob/ob мишки до нивото, открито в постно диво- тип животни в дългосрочен план и след това (2) измерване на лептиновата чувствителност на тези животни, след като са били поставени или на диета с ниско или с високо съдържание на мазнини.

Резултати

Развитието на централна резистентност към лептин при мишки C57Bl/6J изисква излагане на диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 20 седмици [10], [14]. За да установим възможния принос на хиперлептинемията спрямо самата диета с високо съдържание на мазнини за развитието на лептинова резистентност, разработихме експериментален протокол, в който, започвайки от отбиването, плазмените нива на лептин на ob/ob мишки могат да бъдат фиксирани до нивото на постно диви тип мишки (~ 5 ng/mL) за тази продължителност (Фигура 1а). Проведохме обширни проучвания за отговор на дозата, вливайки лептин в ob/ob мишки чрез осмотични инфузионни помпи и установихме, че нивата на лептин от див тип в плазмата от приблизително 5 ng/ml при ob/ob мишки могат да бъдат постигнати чрез доставяне на лептин при 150 ng/h. Тази скорост на вливане може също така да се поддържа стабилно за повече от шест месеца чрез подмяна на помпите на всеки 28 дни.

A. Концентрации на глюкоза в плазмата в мишки ad libitum, хранени от див тип и ob-нормални мишки, които са били на диета с високо съдържание на мазнини (отворени барове) или диета с ниско съдържание на мазнини (напълнени барове). Б.. Концентрации на инсулин в плазмата на мишки от див тип и ob-норма на 18 и 26 седмична възраст, които се поддържат на диета с високо съдържание на мазнини (отворени барове) или диета с ниско съдържание на мазнини (напълнени барове). ° С. Плазмени концентрации на глюкоза в отговор на инжектиране на глюкоза при див тип (черни) и ob-норма (червени) мишки. Триъгълниците представляват мишки на диета с ниско съдържание на мазнини, а квадратите представляват мишки на диета с високо съдържание на мазнини. * показва р 0,5). Това потвърждава, че заместването на лептина на физиологични нива е било достатъчно за нормализиране на глюкозната хомеостаза при слабите ob-нормални животни. За разлика от това, и двете кохорти, изложени на диета с високо съдържание на мазнини, показват забавен клирънс на глюкоза (Фигура 2в; p Фигура 3. Чувствителност към лептин при 12-дневна инфузия.

A. Телесно тегло на животни от див тип, които са получавали лептин (червен) или PBS (черен) инфузия в продължение на 12 дни (сив блок). Б.. Телесно тегло на животни с нормална норма, които са получавали лептин (червен) или PBS (черен) инфузия в продължение на 12 дни (сив блок). ° С. Разлика в загубата на тегло между лептин и носител за всяка кохорта в продължение на 12-дневната инфузия на лептин. Стойностите се изразяват като процентна промяна в телесното тегло. д. Среден дневен прием на храна по време на 12-дневната инфузия за животни във всяка кохорта.

ob-нормални мишки, които са били на диета с ниско съдържание на мазнини, са чувствителни към лептин и показват подобно намаляване на приема на храна като техните аналози от див тип (15,2 ± 1,4 kcal/d за превозно средство спрямо 12,1 ± 1,1 kcal/d за лептин, p = 0,08) и загуба на приблизително 10 процента от телесната им маса по време на 12-дневната инфузия (-2,8 ± 1,1% за контрола срещу -11,6 ± 1,0% за лептина, p Фигура 4. STAT3 фосфорилиране в отговор до остра инжекция с лептин.

A. Оцветяване за pSTAT3 в медиобазалния хипоталамус на мишки на диета с ниско съдържание на мазнини, при която се прилага интраперитонеална инжекция на лептин или носител. Б.. Оцветяване за pSTAT3 в медиобазалния хипоталамус на мишки на диета с високо съдържание на мазнини, при която се прилага интраперитонеална инжекция на лептин или носител. ° С. Количествено определяне на pSTAT3 положителни клетки в дъгообразното ядро ​​за мишки на диета с ниско съдържание на мазнини. д. Количествено определяне на pSTAT3 положителни клетки в дъгообразното ядро ​​за мишки на диета с високо съдържание на мазнини.

След това тествахме ob-нормални мишки в същия анализ. Ob-нормални мишки, поддържани на диета с ниско съдържание на мазнини, показват повишено фосфорилиране на STAT3 в отговор на лептин и степента на това увеличение е подобна на контролите от див тип (10,7 ± 4,5 клетки за носител срещу 71 ± 1,7 клетки за лептин, p 2 ж) бяха изключени от анализа.

Анализи за вливане на лептин

За да се измери чувствителността на животните към краткотрайна инфузия на лептин, микроосмотичната помпа във всяко животно е заменена с 14-дневна помпа (Модел 2002, Durect), която дозира лептин със скорост 450 ng/h над изходното ниво. Това означава, че за диви животни помпите, доставящи PBS, са заменени с помпи, доставящи лептин с 450 ng/h, а за ob/ob животни, помпите, доставящи лептин със 150 ng/h, са заменени с помпи, доставящи лептин с 600 ng/h . Телесното тегло се записва ежедневно и приемът на храна на всеки 6 дни. След 12 дни помпите бяха отстранени и заменени с помпи, дозиращи лептин на изходно ниво (PBS за диви животни и 150 ng/h за ob/ob животни).

Имунохистохимия

Мишките се инжектират или с лептин (2 mg/kg, интраперитонеално) или с носител (PBS). 30 минути след инжектирането животните се анестезират с изофлуран и се перфузират с 10% неутрален буфериран формалин (Sigma, St. Louis, MO). Мозъците се отстраняват чрез дисекция и се накисват във формалин за една нощ при 4 ° C. 50 µm срезове бяха приготвени и оцветени за pSTAT3, както следва [10]. Свободно плаващите секции бяха третирани с 1% H2O2 + 1% NaOH във вода за 10 минути, последвано от 0,3% глицин в PBS за 10 минути и 0,03% SDS в PBS за 10 минути. След това секциите бяха изложени на блокиращ разтвор (PBS, съдържащ 0,1% Triton X-100/2% кози серум/3% BSA) в продължение на 1 час. Фосфо-STAT3 (Tyr 705) антитяло (# 9131, Cell Signaling, Danvers, МА) се разрежда 1: 1000 в блокиращ разтвор и срезовете се оцветяват за 48 часа при 4 ° С. След това секциите се измиват (3 пъти, 20 минути) и се инкубират с вторично антитяло в продължение на 2 часа (конюгирано козе анти-заешко антитяло Alexa 488; Invitrogen, Carlsbad, СА). Секциите се измиват (3 пъти, 20 минути), монтират се на предметни стъкла и се снимат.

За да се определи количествено броят на оцветените клетки, сечение от 300 × 300 пиксела беше премахнато от областта, представляваща дъгообразното ядро ​​във всяко изображение. След това броят на положителните клетки се отчита от наблюдател, заслепен за идентичността на пробата.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: ZAK JMF. Изпълнява експериментите: ZAK KSH MLG. Анализирани данни: ZAK KSH MLG JMF. Написа хартията: ZAK.