Разработване на предклинични модели за фиброза на NASH

Фиброзата на NASH се задвижва от няколко механистични оси, по които могат да действат някои бързи, конвенционални модели на гризачи. Това осигурява набор от бързи модели, които могат да се окажат подходящи за определени кандидати за наркотици:

ръководство

  1. Индукция на токсини от възпаление, стеатоза и клетъчна смърт с използване на въглероден тетрахлорид
  2. Чернодробна стеатоза, предизвикана от диетичен холин и дефицит на метионин
  3. Модели с дефицит на холин от следващо поколение, които подобряват NASH без сериозната загуба на тегло, наблюдавана при предишния модел

Тази публикация сравнява тези конвенционални модели на фиброза, като разглежда техните предимства и ограничения за развитието на фиброза и NASH лекарства.

Модел за въвеждане на въглероден тетрахлорид срещу диетични модели с дефицит на холин

Модели на въглероден тетрахлорид NASH Фиброза

Разтворителят въглероден тетрахлорид (CCl4) е токсин, метаболизиран от чернодробния цитохром P450 до трихлорометилов радикал (–CCl3). Това реагира с многобройни чернодробни цели, за да се постигнат множество NASH-подобни ефекти:

  • възпаление, предизвикано от митохондриални реактивни кислородни видове
  • стеатоза от намалена активност на липидните метаболизиращи ензими и нарушение на GLGD-секретирана VLDL секреция
  • генерализирано клетъчно увреждане, водещо до клетъчна смърт и фиброза

Тези вредни ефекти се проявяват без затлъстяване или инсулинова резистентност и включват значително количество клетъчна смърт, независимо от съхранението на липидите и метаболизма. Следователно, това не представлява вярно NAFLD. Въпреки това има три ключови предимства на модела CCl4.

Първо, това е много лесно за изпълнение, обикновено включващо два пъти седмично интраперитонеални инжекции на CCl4 в продължение на четири до шест седмици, в зависимост от чувствителността на щама на мишката. Популярните и достъпни лабораторни щамове BALB/c, C57BL/6 и DBA/2 имат добре документирана висока до междинна чувствителност. Популярни щамове плъхове, включително Sprague Dawley и Wistar, също са подходящи.

Второ, моделът представя много от хистологичните характеристики на човешкото заболяване. Това включва прогресивна фиброза, преминаваща от перицентрални области към тежка мостова фиброза, след това хепатоцелуларен карцином. Изтичането на чернодробни трансаминази (ALT, AST) осигурява лесно количествено циркулиращи биомаркери за прогресиране на чернодробното заболяване, докато цитокините TNFα и IL-6 са маркери за възпаление. Тежестта на заболяването зависи от дозата и фиброзата може да бъде спонтанно обратима, ако се използва субоптимален режим, което може да обърка ефикасността на тестовите изделия, обръщащи NASH. Като цяло моделът CCl4 е добре характеризирана система за оценка на ефикасността на терапиите с NASH, започвайки от предсказуема тежест.

И накрая, хепатоксичността на CCl4 включва много механизми, които са цели за усилията за разработване на лекарства за лечение на NASH. Те включват индуциращата апоптоза NLRP3 инфламазома и профибротичната активност на трансформиращия растежен фактор β. По-специално, експресията на фарнезилХ рецептора (FXR) се потиска от CCl4. Фармакологичното спасяване на FXR активност с използване на обетихолова киселина (OCA) се оказа защитно в този модел; Широко се очаква OCA да стане първото одобрено от FDA лекарство NASH по-късно тази година.

Освен липсата на истинска преводимост на човешки NAFLD/NASH, същественият недостатък на този модел е системната токсичност, засягаща нехепаталните органи и тъкани. Друго предизвикателство на CCl4 е потенциалната химическа опасност за техника. Този модел трябва да се изпълнява само от обучени оператори с подходящо защитно оборудване и инфраструктура за химическа безопасност.

Дефицитна на холин диета NASH Модели за фиброза

Недостигът на холин се използва в няколко поколения модели на NASH с диетични гризачи. Холинът, заедно с метионин, са ключови хранителни вещества, необходими за чернодробното митохондриално β окисляване и синтеза на липопротеини с много ниска плътност (VLDL). Когато се хранят с диета с дефицит на метионин/холин (MCD), износът на триглицериди се възпрепятства, предизвиквайки бързо чернодробна стеатоза и възпаление.

Подобно на CCl4, MCD диетата е популярна със своята лекота и бързо индукционно време. Силното повишаване на серумния ALT/AST настъпва в рамките на две седмици и клиничните резултати на NAFLD достигат почти максимални стойности за същия период от време. Фиброзата също настъпва бързо, като става очевидна само за 4 седмици и тежка в рамките на 10 седмици. Фиброзата е обратима след време, което не надвишава 16 седмици, поради което моделът трябва да се използва за удължения период от време за оценка на агентите за подобряване на NASH. Изборът на животни обаче е по-ограничен, отколкото за модел CCl4. C57Bl/6 мишки са предпочитан миши щам; плъховете ще развият силна стеатоза, но само леко възпаление и липса на фиброза.

Има многобройни транслационни и практически недостатъци на модела MCD. Най-очевидно животните изпитват бърза и тежка загуба на тегло - над 40% от началото на диетата - както и намалена серумна глюкоза, триглицериди и холестерол. Тази степен на загуба на тегло представлява последици за благосъстоянието и поставя предизвикателствата за боравене с животни и дозиране за оператора, докато метаболитните фенотипове са точно противоположни на човешкото състояние. Транскриптомните промени на модела също са критикувани като слабо представителни за човешкия NAFLD.

Диети с дефицит на холин от второ поколение

Диетите с дефицит на холин от второ поколение също се оказаха популярни за предизвикване на NAFLD/NASH при гризачи без сериозната загуба на тегло при MCD диетата. Диетата с дефицит на холин с L аминокиселина (CDAA) замества съдържанието на протеин с точна еквивалентност на L аминокиселини. Въпреки че не е представен в съкращението, диетата CDAA също е намалена (но не и изчерпана) за метионин. Мишките C57Bl/6 и BALB/c на CDAA развиват стеатоза и възпаление в рамките на 3 седмици. Началото на фиброзата е на 6 седмици и фиброзата става леко-умерена около 21 седмица и това също е обратимо.

Тази диета е подходяща и за предизвикване на NAFLD/NASH при плъхове Wistar и Fisher, с подобни времеви рамки за появата и прогресирането на заболяването, както при мишките. Въпреки че загубата на тегло не е недостатък на този модел и при двата гризача, човешки метаболитни фенотипове, предшестващи NAFLD (инсулинова резистентност, хипергликемия, липидемия и др.) Отсъстват в този модел.

Обогатяването на калоричното съдържание на мазнини в CDAA от 10-20% на 60% (дефицит на холин, дефинирана L аминокиселина, диета с високо съдържание на мазнини; CDAHFD) ускорява и влошава NASH и значително намалява спонтанната обратимост на фиброзата. Тази модификация е подходяща за оценка на фибролитични агенти в терапията с NASH. Този модел също напредва при цироза, портална хипертония и чернодробна недостатъчност в рамките на 24 седмици при мишката C57Bl/6, така че е доста универсален за изследователски проекти за чернодробни заболявания. Независимо от това, отличителните белези на метаболитния синдром, включително затлъстяване, хипергликемия и хипертриглицеридемия, липсват в тази итерация на диетата с дефицит на холин.

Последният вариант на CDAHFD, който води до още по-тежко чернодробно увреждане и чернодробна фиброза без тежка загуба на тегло, е добавената нова диета с холестерол, фиброза с дефицит на холин (CCDF). Свободният холестерол има токсични свойства, които стимулират възпалителните реакции, усилвайки смъртта на хепатоцитите и фиброзата. CCDF включва клинично значими количества холестерол (приблизително 1% от теглото). Данните както при плъхове Wistar, така и при мишки C57BL/6 показват, че диетата CCDF предоставя ценна платформа за индуциране на чернодробна стеатоза и фиброза само за 6-9 седмици и създава един от малкото модели плъхове на NASH/фиброза при диета с високо съдържание на мазнини.

Ограничения на конвенционалните модели на гризачи

Една основна забележка за тези модели и предизвикателство за предклиничното развитие на лекарствата NASH като цяло е тяхната преносимост. По-ранна публикация в блога се занимаваше с диети, които интегрират лошите хранителни навици на западните популации, хранени с животни с податливост или полигенна предразположеност към метаболитни заболявания. Това настоящо поколение модели са най-добрите в класа си по отношение на рекапитулирането на човешко заболяване, но изискват дълги индукционни времена за крайни точки и имат висока вариабилност между животни.

Заключение

Класическият модел на хепатотоксичност CCl4 и множество итерации на индуцирана от холиновата недостатъчност стеатоза осигуряват добре характеризиран и широко достъпен набор от модели на гризачи за NASH и фиброза на черния дроб. Когато избирате модели на диета с индукция на въглероден тетрахлорид или с недостиг на холин, заедно с техните предимства, трябва да вземете предвид многобройните им ограничения по отношение на преносимостта за човешкото състояние. Всички модели, обобщени тук, не представят отличителни белези на метаболитния синдром, който обикновено предшества човешката мастна чернодробна болест.

В подходящ научен контекст обаче те позволяват бърза и подходяща предклинична характеристика на терапията с NASH и могат да бъдат оправдани алтернативи на използването на по-бавни, но по-преводими модели от най-добрия в класа, включващи западни диети и щамове на гризачи с полигенни предразположения за чернодробни заболявания.