Резюме

Заден план

Пилетата се считат за основен резервоар за човешка кампилобактериоза. Малко се знае за взаимодействието между Campylobacter jejuni (C. jejuni) и пилета. Това взаимодействие може да бъде повлияно от етапа на зреене на имунната система, развитието на чревния микробиотен състав и други фактори, включително породата и диетата. Нашата цел беше да изследваме въздействието на породата и диетата върху C. jejuni колонизация и имунни отговори на гостоприемника при пилета. Птиците бяха инокулирани с 10 4 единици, образуващи колонии (CFU) от C. jejuni или разредител в един (Exp. 1) или 22 (Exp. 2) дни след излюпването. Сравнихме местните субпопулации на имунните клетки, нивата на експресия на цитокини и състава на микробиотата на червата между птици от бройлер (BT) и тип слой (LT), хранени или с търговски фураж за бройлери (bf) или с фураж от слоеве (lf).

влияят

Резултати

По-ниски нива на колонизация се наблюдават в по-старата възрастова група, независимо от породата и диетата. Независимо от породата, птиците, хранени с bf, показват по-висок CFU от C. jejuni в сравнение с групите, хранени с лф. Campylobacter jejuni-инокулацията е имала значителен ефект върху броя на лимфоцитите и нивата на експресия на цитокини при BT птици, независимо от стратегията за хранене (стр

Заден план

Campylobacter видове, по-специално Campylobacter jejuni (C. jejuni), причиняват по-голямата част от хранителните бактериални гастроентерити в индустриализирания свят [1, 2]. Campylobacter jejuni се среща в редица опитомени животни, а пилетата са преобладаващият резервоар за C. jejuni [3]. Досега не са приложени подходящи стратегии, които позволяват надеждна профилактика на C. jejuni колонизация на пилета на полето [4]. Намаляването на C. jejuni степента на колонизация може да бъде постижима цел [5, 6]. Докато про- и пребиотиците са довели до противоречиви резултати [7–9], други мерки за контрол, включително стратегии за хранене и използването на по-устойчиви породи, могат да позволят значително намаляване на C. jejuni колонизация [10–12].

Често само една публикация от времевата точка C. jejuni инокулацията е изследвана, без да се отчита динамиката на колонизация [17, 24].

Ролята на Т клетките в контрола на C. jejuni при мишки и хора е демонстрирано, но малко се знае за отговора на Т-клетките при пилета [15, 25, 26]. Предполага се, че C. jejuni инфекциите при птичи видове са свързани с Th1 поляризация на имунния отговор [27, 28].

Може да се предположи, че промените в диетата на домашните птици могат да променят микробиотата на слепоочието и здравето на пилетата и следователно да повлияят съответно на наличието на C. jejuni в пилешките черва. Последните проучвания показват, че стратегията за хранене може да промени вискозитета на съдържанието на червата, както и хистоморфологията на пилешките черва [11], и да модифицира гликоконюгатите на бокаловите клетки в чревния тракт in vitro [29]. Не е напълно ясно как различните стратегии за хранене могат да променят модела на колонизация на чревните бактерии, развитието на местен имунитет и впоследствие да модулират локалните имунни реакции в отговор на C. jejuni колонизация. Повечето от тези проучвания са проведени при бройлери и са фокусирани върху връзката между тях C. jejuni колонизация и хранителни промени [10, 30–32].

Целта на това проучване беше да се изследва взаимодействието между породата и стратегията за хранене C. jejuni колонизация при търговски хибриден слой и птици от бройлери с кръстосано проучване. Campylobacter jejuni-инокулираните и не инокулираните групи от двете породи са били хранени или с търговски фураж за бройлери (bf), или с фуражен слой (lf). Изследвахме локални и системни имунни реакции, както и възможни разлики в състава на чревната микробиота. Нашите данни ясно показват, че съставът на фуражите, както и породата, са повлияли на резултата от C. jejuni колонизация, развитие на имунитет и чревна микробиота, осигурявайки основата за последващи проучвания относно възможността за намаляване на C. jejuni колонизация чрез селекция за по-устойчиви породи в комбинация със защитни стратегии за хранене.

Методи

Животни

Ембрионирани яйца от кокошки хибриди от слоен тип (LT) (Lohmann Selected Leghorn, LSL) са предоставени от KG Geflügelzuchtbetriebe Gudendorf-Ankum GmbH & Co. KG, Ankum, Германия и яйца от търговския бройлер Ross-308 (BT) ) пилета са получени от люпилнята BWE Weser-Ems GmbH & Co. KG, Visbek, Rechterfeld, Германия. Яйцата бяха инкубирани и излюпени в Клиниката за птици, Университет по ветеринарна медицина Хановер, Германия. Пилета бяха настанени и отглеждани в Клиниката по птици, Университет по ветеринарна медицина Хановер.

Всички птици BT или LT се държат в една и съща стая на дървени стърготини до епохата на инокулация. След това инокулираните и не инокулираните експериментални групи бяха преместени в различни изолационни помещения (една за инокулирани и една за не инокулирани контролни птици) с единици с телени подове. Всички групи са получили фураж от един и същи източник (фураж от бройлер или отслоен тип, захранван или от птици BT или LT).

Търговски бройлери и фуражни храни (Таблица 1), както и вода са предоставени ad libitum. Птиците са били хранени със стандартна начална диета до 14-дневна възраст и след това са получавали диета за отглеждане до края на експеримента. Птиците бяха разпределени на случаен принцип в различни групи въз основа на SRS (проста произволна проба) и наблюдавани ежедневно за наличие на клинични признаци. Всички тествани птици са отрицателни за C. jejuni чрез клоакални тампони в деня на C. jejuni инокулация. Животните не са получили никаква ваксинация.

Бактериални щамове и C. jejuni подготовка на инокулум

The C. jejuni щам серогрупа Lior6 е изолиран от пиле в Клиниката по птици, Университет по ветеринарна медицина Хановер, Германия и е съхраняван в обезмаслено мляко при -70 ° C [26].

Криоконсервираните бактерии бяха размразени и нанесени върху въглен цефоперазон дексоксихолатен агар (CCDA, Oxoid, Basingstoke, Англия). Плаките се инкубират в продължение на 48 часа при микроаерофилни условия (10% CO2, 5% O2, 85% водород) при 38 ° С. След 2 дни, един C. jejuni колония се прехвърля в 3 ml Standard-I-Bouillon (Merck, Damstadt, Германия) и се инкубира за още 48 часа при микроаерофилни условия при 38 ° C.

Един милилитър от бактериалната суспензия се разрежда със стерилен физиологичен разтвор, буфериран с фосфат (PBS), за да се постигне приблизително 10 4 CFU/ml (единици за образуване на колонии) за орално инокулиране. За да потвърдите CFU на C. jejuni в инокула бактериалната суспензия се разрежда последователно в 10-кратна серия от разреждания, разпределя се върху CCDA плаки и се инкубира в продължение на 48 часа при 38 ° С. След инкубация колониите бяха преброени за изчисляване на CFU [17].

Изолиране на интраепителни лимфоцити и проточен цитометричен анализ

Едноклетъчни суспензии на интраепителни лимфоцити (IEL) се приготвят, както е описано подробно по-рано [33].

Хистология

Бяха събрани проби от черен дроб и средна цекума, фиксирани във фосфатно буфериран формалин (4%) за 24 часа и допълнително обработени за хистологично изследване след стандартни процедури. Различните тъканни участъци от 2 µm са изследвани микроскопски за хистопатологични лезии като оток в ламина проприя на абсцеси на цекума или крипта и балониране на клетки, както е описано по-рано при мишки и пилета след C. jejuni инокулация [36, 37].

Имунохистохимия

Замразените срезове на средната цекума са обработени, както е описано по-горе [33, 38]. Секциите се оцветяват с едно от следните моноклонални антитела срещу мишки срещу пиле: анти-CD4, анти-CD8β и анти-Bu1 (0,05 µg/ml) (Southern Biotech, предоставено от Biozol, Eching, Германия). Вторичните антимиши IgG биотинилирани антитела и ABC реагент (Vectastain ® Elite ® ABC Kit, Vector Laboratories Inc., предоставен от Linaris, Wertheim-Bettingen, Германия) бяха приложени в съответствие с инструкциите на производителя. Ензимно свързаният ABC комплекс се визуализира чрез реакцията с 3.3'-диаминобензидин (DAB) хромагенен субстрат и водороден пероксид (DAB пероксидазен субстратен комплект, Vector Laboratories Inc.). Разрезите бяха изследвани със светлинна микроскопия. Различните популации на лимфоцити бяха оценени чрез преброяване на броя на положителните оцветени клетки на 3 крипти в lamina propria от 5 представителни микроскопични полета при 200 × оптично увеличение на животно [33].

Количествена RT-PCR в реално време (qRT-PCR)

Обща РНК беше изолирана от проби от цекум с 1000 µl реагент Trifast ® -GOLD (PeqLab, Biotechnologie GmbH, Erlangen, Германия), съгласно инструкциите на производителя. Качеството на РНК и концентрациите са определени с помощта на NanoDrop ND-1000 (PeqLab, Biotechnologie GmbH).

Всички подробности за специфичните праймери и сонди за откриване на експресирани цитокини IL-6 и пилешки IL-8 хомолог, както и домакинският ген 28S са описани по-рано [15, 39]. Количествената RT-PCR в реално време се извършва с помощта на AgPath-ID едноетапен RT-PCR комплект (Applied Biosystems, Ambion, САЩ). Амплификацията и количественото определяне на специфичните продукти бяха извършени чрез използване на системата за термичен цикъл Mx3005P ™ и PCR софтуер Mx3005P ™ Q (STRATAGENE, Agilent Technologies Company, САЩ), съответно. Приложен е следният профил на цикъла: един цикъл при 50 ° C за 30 минути и 95 ° C за 10 минути и 40 цикъла при 95 ° C за 20 s и 60 ° C за 1 минута.

Резултатите бяха нормализирани с домашния ген 28S [40], експресията на който беше сравнима между птиците от C. jejuni-инокулирани и не-инокулирани и се изразяват като 40-Ct в експресия на иРНК в тъканите на C. jejuni инокулирани птици и C. jejuni-безплатни контроли.

ДНК пречистване и пиросеквенция

Анализ на последователността

Файловете Fasta и qual, генерирани след последователността на Illumina, бяха качени в софтуера Qiime [41]. Обратните четения бяха съкратени до дължина от 250 bp и бяха обединени последователностите напред и назад. Критериите за качествено подрязване бяха зададени на стойност 19 и няма несъответствие в MID последователностите. В следващата стъпка химерните последователности бяха предсказани от алгоритъма на убиеца и изключени от последващия анализ. След това получените последователности бяха класифицирани от RDP Seqmatch с ниво на дискриминация OTU (оперативни таксономични единици), зададено на 97%, последвано от анализ на UniFrac [42]. За визуализация на данните е използван главен координатен анализ (PCoA).

Експериментален дизайн

Експеримент 1 (Опит 1)

Експеримент 2 (Exp. 2)

Опит 1 се повтаря с 22-дневни птици. 72 търговски бройлери и 72 пулвери с търговски слой бяха разделени на две подгрупи. 18 птици на подгрупа бяха орално инокулирани с нито една от двете C. jejuni-свободна среда или приблизително 10 4 CFU от C. jejuni при 22 dph. Повечето параметри са изследвани, както е описано в Exp. 1. Нивата на експресия на цитокини и съставът на чревната микробиота не са определени в този експеримент.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха извършени с Statistix версия 10.0 (Аналитичен софтуер, Thallahassee, FL, САЩ). За статистическия анализ на разликите в броя на CFU от C. jejuni на различни C. jejuni-инокулирани подгрупи от една и съща възраст при посочения dpi, беше използван тест за двойни сравнения на Kruskal – Wallis. Разликите в подгрупите на IEL Т клетки и броя на популациите на LPL имунни клетки между C. jejuni-инокулираните и не инокулираните контроли се определят чрез две проби т тест или сума на ранга на Wilcoxon т тест, съответно. Разликата в нивото на експресия на цитокини между C. jejuni-инокулирани и C. jejuni-свободните контролни групи се определят чрез две проби т тест. Статистическата значимост беше обозначена като стр

Резултати

Клинични признаци и тъканни лезии

Не са наблюдавани клинични признаци, макроскопични или микроскопични лезии в цекума на нито един от тях C. jejuni-безплатен контрол или C. jejuni-инокулирани групи и в двата експеримента. Не са установени значителни разлики в телесното тегло между C. jejuni-инокулирани и не инокулирани контролни птици във всяка порода и диетична група в различните дни на аутопсия (данните не са показани, стр > 0,05). Птиците BT и LT, хранени със слоен фураж (lf), са имали значително по-ниско телесно тегло през всички дни на аутопсия в сравнение с групи за хранене с бройлери (bf), хранени от съответната порода (данните не са показани, стр Таблица 2 Среден брой образуващи колонии единици от C. jejuni в цекално съдържание на бройлери и птици от тип бройлер, хранени с бройлери или фуражи

В допълнение в Exp. 1, LT птици, хранени с bf, показват по-голям брой CFU от C. jejuni в сравнение с BT птици в повечето от изследваните моменти от време. Този ефект е открит само в Exp. 2 при 1 dpi, докато в по-късни моменти време BT птиците са имали по-високи нива на колонизация от LT птиците.

Откриване на локални чревни популации на лимфоцити

Имунохистохимично откриване на Т и В лимфоцити в ламина проприя на цекума

Както се очаква въз основа на предишни проучвания [17], броят на популациите на Т- и В-лимфоцити в lamina propria е повлиян от възрастта. Цекалните CD4 +, CD8 + и Bu1 + LPL постепенно се увеличават при контролни птици с течение на времето (фиг. 1, 2).