Резюме

Заден план

Това проучване има за цел да анализира ефекта от упражненията и/или промяната в диетата върху подобряването на безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) при индуцирани от хронична диета с високо съдържание на мазнини (HFD) затлъстели мишки.

Методи

Четиридесет мъжки мишки C57BL/6 (на 8 седмици) бяха разделени на нормална диета (CO, н = 8) и диета с високо съдържание на мазнини (HF, н = 32) групи. Групата с HF е хранена с 60% мазнина чау в продължение на 16 седмици, за да предизвика затлъстяване. След периода на индукция на затлъстяването HF групата се подразделя на HFD + заседнал (н = 8), HFD + обучение (HFT, н = 8), диетична промяна към нормална диета + заседнал (HFND, н = 8) и промяна в диетата към нормална диета + обучение (HFNDT, н = 8) групи, а мишките в тренировъчните групи са преминали обучение на бягаща пътека в продължение на 8 седмици, 5 пъти седмично, 40 минути на ден.

Резултати

24-седмично HFD индуцирано увеличаване на експресирането на протеиновата киназа (AMPK) на протеина киназа (AMPK) на канабиноид-1 рецептор (CB1), синтаза на мастни киселини (FAS) (стр

Заден план

Мастната чернодробна болест се характеризира с натрупване на липиди, главно триглицериди, в хепатоцитите при липса на конкурентни етиологични заболявания на черния дроб, което е ранен стадий на чернодробно заболяване, като алкохолно чернодробно заболяване, неалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD) хепатит С [1]. И двете патологични състояния, включително централно затлъстяване, диабет тип 2, дислипидемия, хипертония и фактори, свързани с начина на живот, като физическо бездействие и диети с високо съдържание на мазнини, са рискови фактори за развитието на NAFLD [2]. Общото разпространение на NAFLD в световен мащаб се оценява на 25%, а разпространението на NAFLD в азиатските популации се оценява на 27% [3]. Тъй като разпространението на NAFLD се увеличава в световен мащаб и представлява бреме за общественото здраве, са необходими подходящи решения за облекчаване на NAFLD.

Сред предложените механизми на прогресия на NAFLD, липогенната активация на транскрипционен фактор [4] и нарушените функции на липолитичния транскрипционен фактор [5] са пряко свързани с развитието на мастния черен дроб. Канабиноид-1 рецепторът (CB1), който реагира на канабиноиди, които увеличават приема на мазнини, регулира активността на тези липогенни и липолитични транскрипционни фактори [6, 7], а приемът на етанол и диета с високо съдържание на мазнини предизвиква повишаване на активността на CB1 чрез повишена синтез на ендоканабиноиди, 2-AG и анандамид [1]. Тъй като CB1 също е надрегулиран при затлъстяване, CB1 е потенциална терапевтична цел за затлъстяване и NAFLD [8].

CB1 антагонистът Rimonabant (Acomplia, Sanofi-Aventis) първоначално е разработен за лечение на затлъстяване и ефектът му е по-добър от очакваното [9,10,11]. Безопасността на Rimonabant обаче е била обезпокоителна поради появата на централни неблагоприятни ефекти, включително гадене, безпокойство, нарушения на съня и депресия, и клиничните изпитвания в крайна сметка са прекратени [12]. Въпреки че са повдигнати твърдения за разработване на лекарства, че CB1 антагонистите трябва да насърчават непрекъснатите усилия за разработване на периферно ограничени молекули, които ще предотвратят потенциални неблагоприятни централни ефекти [8], до момента няма забележителни постижения.

Предишни проучвания съобщават, че е необходимо определено ниво на намаляване на теглото, за да се облекчи NAFLD [13, 14]. Упражненията са един от най-ефективните начини за намаляване на телесното тегло и натрупването на мазнини чрез улесняване на метаболитните процеси без никакви странични ефекти. Диетичните ограничения или диетичното превръщане в нискокалорични също са добре известни като ефективно лечение за отслабване. По този начин се препоръчват редовни упражнения и диетична намеса за облекчаване на НАЖХП чрез намаляване на теглото. Няколко проучвания изследват ефектите от упражненията с диетични ограничения върху подобряването на NAFLD, но ефектът от самото лечение на упражненията, който не предизвиква намаляване на теглото, все още е неясен.

Следователно целта на това проучване е да се анализира ефекта от упражненията и/или диетичните промени върху подобряването на NAFLD при хронични мишки със затлъстяване, индуцирани с високо съдържание на мазнини (HFD).

Методи

Животни и поддръжка

В това проучване са използвани 40 мъжки мишки C57BL/6 (на 8 седмици). Четири мишки бяха настанени на клетка в лабораторията за животни на Университетския колеж Dong-A. Лабораторните условия се поддържат постоянни: 55% относителна влажност, 22 ± 2 ° C и 12-часов цикъл тъмна светлина. Експериментите с животни бяха одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университетското медицинско училище Dong-A (DIACUC-одобрение-16-17) и всички процедури бяха извършени в съответствие с насоките на комитета.

Индукция на затлъстяването

Животните бяха разделени на случаен принцип в две групи, за да се предизвика затлъстяване: нормална диета + заседнала група (ND, н = 8) и HFD + заседнала група (HF, н = 32). В продължение на 16 седмици HF групата е хранена с 60% мазнини (60% липиди, 20% въглехидрати и 20% протеин), за да предизвика затлъстяване, докато групата CO е хранена със стандартна чау (6,3% липид, 69,4% въглехидрати и 24,3% протеин). Телесното тегло се измерва ежеседмично през целия експериментален период.

Упражнение и диетична намеса

След 16 седмици индукция на затлъстяването, мишките от групата на HF бяха произволно подразделени на HF (н = 8), HFD + обучение (HFT, н = 8), диетична промяна към нормална диета + заседнал (HFND, н = 8) и промяна в диетата към нормална диета + обучение (HFNDT, н = 8) групи. Животните от групите HFT и HFNDT са преминали обучение за упражнения на бягаща пътека за животни пет пъти седмично в продължение на осем седмици. Интензивността на упражнението беше коригирана на 5 m/min за 5 min, 12 m/min за 30 min и 5 m/min за 5 min, при наклон от 0% за първите четири седмици на тренировка. Интензивността на упражнението беше увеличена до 5 m/min за 5 min, 14 m/min за 30 min и 5 m/min за 5 min, също при 0% наклон за последните четири седмици на обучение [15].

Тест за толерантност към глюкоза

Както беше описано по-рано [16], интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза (GTT) беше извършен след 16-часово бързо гладуване през нощта. Плазмените концентрации на глюкоза се измерват в опашната кръв с помощта на тест лента за кръвна глюкоза GlucoDr (Allmedicus, Anyang, Южна Корея) преди и 30, 60, 90 и 120 минути след интраперитонеално инжектиране на болус глюкоза (1 mg/g) за GTT.

Вземане на проби от тъкани

Вземането на проби от тъкани беше проведено 48 часа след завършване на последното упражнение, за да се предотвратят временни ефекти от тренировката. Храната се отстранява от клетките на мишките 12 часа преди мишките да бъдат умъртвени. Чернодробните тъкани се изрязват след пълна анестезия (етилов етер) и извлечените проби веднага се претеглят, замразяват се в течен азот и се съхраняват при - 80 ° C.

Оцветяване с хематоксилин и еозин

Малки парченца чернодробна тъкан бяха фиксирани с формалин (10% формалин с неутрален буфер) и вградени в парафин. Пет-микрометров участък бяха изрязани и оцветени с помощта на хематоксилин и еозин (H&E). Цифровите изображения на диапозитивите са заснети с Aperio ScanScope (Aperio, САЩ).

Екстракция на чернодробни триглицериди

Чернодробните проби се претеглят (50 mg) и към всяка проба се добавят 200 μl етанолов KOH (2 части етанол: 1 част 30% KOH) и се инкубират една нощ при 55 ° С. Впоследствие се смесва с 50% етанол във всяка епруветка, за да се достигне обемът до 0,5 ml и се центрофугира в продължение на 5 минути при 13 000 об/мин. Супернатантата се прехвърля в нови епруветки и 50% етанол се добавя отново във всяка епруветка, за да се увеличи обемът до 0,6 ml. След завихряне 200 μl се преместват в нова епруветка и се добавят 215 μl от 1 M MgCl2, инкубират се за 10 минути върху лед и се центрофугират за 5 минути при 13 000 об/мин. Супернатантата се използва за измерване на чернодробна TG, като се използва триглицерид-S реагент на ASAN (Asan Pharmaceutical, Сеул, Южна Корея) чрез ензимен колориметричен метод. Чернодробните лизати и стандарти се добавят в микроплаката и се инкубират при 37 ° С в продължение на 10 минути. Стойностите на абсорбцията са измерени при 550 nm.

Уестърн блотинг

Както беше описано по-рано [15], чернодробните тъкани бяха лизирани в 200 μl радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) буфер за извличане на протеин от пробите. Тъканта се хомогенизира и центрофугира за 30 минути при 14 000 rpm. Концентрацията на протеин в супернатантата беше измерена с помощта на BCA комплект за анализ на протеин (PIERCE, САЩ). Проби с еднакво съдържание на протеин се разделят чрез SDS-полиакриламиден гел електрофореза върху 10 или 12% гел и се прехвърлят в мембрана. Мембраната се блокира с 5% обезмаслено мляко във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и впоследствие се инкубира при 4 ° C през нощта с първични антитела (разреждане 1: 1000) срещу CB1 (sc-293419), синтаза на мастни киселини (FAS, sc -74540), карнитин палмитоилтрансфераза1 (CPT1, sc-393070) (всички от Santa Cruz Biotechnology, САЩ), AMP-активирана протеин киназа (AMPK, # 2532, Cell Signaling Technology, САЩ) и фосфор-AMPK (p-AMPK, # 2531, Технология за клетъчна сигнализация). Мембраната се инкубира с козе анти-мише или анти-заешко IgG конюгирано вторично антитяло за 1 h при стайна температура. Сигналът е разработен с ECL решение (Amersham Pharmacia Biotech, САЩ) и е визуализиран със системата ImageQuant ™ LAS-4000 (GE Healthcare, Швеция).

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени със Статистически пакет за социални науки (версия 22.0); стойностите бяха представени като средни стойности ± SE. За сравнение на групите извършихме дисперсионен анализ, използвайки най-малкия квадратен различен post hoc тест, за да потвърдим значителни разлики. Ниво на значимост от стр = 0,05 се използва като праг за статистическа значимост.

Резултати

Хронично HFD индуцирано затлъстяване, глюкозен толеранс и натрупване на мазнини в черния дроб

Телесното тегло в HF групата е значително по-високо от това в CO групата след 16 седмици HFD (стр Фиг. 1

облекчават

Както упражненията, така и/или диетичната намеса облекчават наддаването на телесно тегло, толерантността към глюкозата и натрупването на мазнини в черния дроб

Осем седмици редовно упражнение и/или диетично преобразуване показват подобрение на затлъстяването, причинено от хронична HFD. Телесното тегло в групите HFT, HFND и HFNDT е значително по-ниско от това в групата HF (стр Фиг. 4

Дискусия

В това проучване потвърдихме, че експресията на CB1 и FAS протеин е увеличена в чернодробната тъкан на хронични HFD мишки, а експресията на AMPK и CPT1 протеин е намалена. След комбинация от редовно упражнение и намеса в диетата обаче, синтезът на мазнини намаля и бета окислението на мастните киселини се увеличи. Освен това, самото упражнение също индуцира подобряване на теглото на черния дроб, TG на черния дроб с бета окисление на мастни киселини се увеличава без ползи от загуба на тегло.

Общото разпространение на NAFLD в световен мащаб и в азиатските популации се оценява на> 25% [3] и също рязко се е увеличило през последните няколко десетилетия в корейските популации [17]. Прогресията на NAFLD обикновено е бавна в продължение на повече от десетилетие и в повечето случаи е безсимптомна [18] и 10–20% от пациентите с NAFLD в крайна сметка прогресират не само до неалкохолен стеатохепатит, но и до многоорганни системни заболявания [ 17].

Излишното натрупване на мазнини в черния дроб може да е резултат от (а) повишен синтез на новомастни киселини de (b), увеличен транспорт на мастни киселини от другите органи до черния дроб, (в) намалено окисление на мастните киселини и (г) намален транспорт на триглицериди от черния дроб до други органи [1]. В това отношение превишаването на липидите в организма поради HFD може пряко или косвено да насърчи натрупването на мазнини в черния дроб. Доказателствата, показващи, че повишаването на липогенните фактори и намаляването на липолитичните фактори, индуцирано натрупване на мазнини в черния дроб, са били добре известни както чрез проучвания при хора [19, 20], така и върху животни [21, 22]. В това проучване, както се очаква, хроничният HFD повишава липогенния фактор, като FAS с намалени липолитични фактори, като AMPK и CPT1, което предизвиква повишено натрупване на мазнини, размер и тегло на черния дроб.

Заключение

Дори в случай на затлъстяване, индуцирано от хронична HFD, упражненията и/или диетичната интервенция имат превантивни и терапевтични ефекти върху натрупването на мазнини в черния дроб, резултат от повишаване на липолитичните фактори. Следователно, резултатите от това проучване предполагат, че лечението на упражнения самостоятелно без диетична промяна също е довело до подобряване на NAFLD и глюкозен толеранс без ползи от загуба на тегло.