Шафикул А. Саркър

1 ICDDR, B, GPO Box 128, Дака 1000, Бангладеш

успешно

2 Университетска болница Karolinska, Huddinge, Стокхолм, Швеция

Неха Пант

2 Университетска болница Karolinska, Huddinge, Стокхолм, Швеция

Лех Р. Джунджа

3 Отдел за хранителни храни, Taiyo Kagaku Co. Ltd., Akahoiri Shinmachi, Yokkaichi, Япония

Ленарт Хамарстрьом

2 Университетска болница Karolinska, Huddinge, Стокхолм, Швеция

Резюме

Ролята на специфичните имуноглобулини в местата на лигавицата за осигуряване на защита срещу болести, като диария, свързана с ротавирус, е добре установена. По-рано е доказано, че оралната имуноглобулинова терапия с получени от яйчен жълтък антиротавирусни имуноглобулини постига умерен терапевтичен ефект при диария в резултат на клинично изпитване. Тук са представени данни за терапевтичния потенциал на същия имуноглобулинов препарат при модел на бебета на мишка на диария, предизвикана от ротавирус. Използването на животински модел позволи да се оцени терапията с по-високи дози имуноглобулини и предполага, че подобрен терапевтичен ефект може да се постигне чрез увеличаване на дозата в клиничните условия.

ВЪВЕДЕНИЕ

Профилактичното използване на имуноглобулини води до подобрен резултат, тъй като инфекцията може лесно да бъде потушена. Профилактичното приложение на имуноглобулини обаче обикновено не е възможно. Доколкото ни е известно, клиничното изпитване от Sarker и колеги (4) е първото и единствено терапевтично оценяване на IgY срещу ротавирус при хора. Титърът на IgY в крайния препарат е относително нисък и само 1,5 g имуноглобулини (в 10 g имунизиран яйчен жълтък на прах) могат да бъдат дадени на ден. Въпреки че терапевтичната ефикасност на IgY в това проучване беше умерена, използвайки малък животински модел на диария, свързана с ротавирус, ние изследвахме дали може да се постигне подобрен терапевтичен ефект с по-високи дози IgY.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Анти-ротавирусни IgY имуноглобулини

Имуноглобулинът от яйчен жълтък е получен от отдел Nutritional Foods, Taiyo Kagaku Co., Ltd., Yokkaichi, Япония. Производството на хиперимунизиран яйчен жълтък (HEY) имуноглобулин е описано по-рано от Hatta et al. (6,7). Накратко, белите кокошки на възраст 150 дни са имунизирани интрамускулно с 1 × 10 7 флуоресцентни клетки, образуващи единици (FCFU) от човешки ротавирусни щамове - Wa, RV5, RV3 и ST3 - два пъти с интервал от една седмица, използвайки пълен адювант. След първоначалната имунизация яйцата се събират ежедневно и се съхраняват на студена температура в продължение на две седмици. След това жълтъците им се отделят, обединяват и замразяват за пречистване на IgY. Пречистването на HEY от обединени яйца, събрани 4 до 22 седмици след имунизацията, е в съответствие с процедурите, описани от Hatta et al. (6,7) и Polson et al. (8). Неутрализиращият титър, измерен в тест за неутрализация спрямо серотип 3, е 1: 100 000 (9). Съдържанието на протеини в препаратите е 68,7%, със съдържание на IgY 20%.

Експерименти с животни

Четиринадесетдневни бременни, отрицателни за ротавирус мишки Balb/c са получени от Taconic Labs, Дания. Мишките бяха настанени индивидуално в съоръжението за животни в болница Huddinge, Стокхолм, Швеция. Нормална гранулирана диета и вода бяха осигурени ad libitum. Комитетът по етика на животните в Университетската болница Karolinska в Huddinge, Стокхолм, одобри проучването. Малките са родени на 19-20 ден от бременността, а четиридневните малки са рандомизирани в различни експериментални групи. Кученцата бяха орално оразявани с 2 × 10 7 образуващи огнища единици (FFU) от резус ротавирус (щам RRV) в обем от 10 μl на ден 0 от експеримента. Храненето с анти-ротавирусен IgY в общ обем от 10 μl фосфатно-буфериран физиологичен разтвор започва от ден 1 до ден 5. Тествани са четири различни дози IgY: 10 mg/ml (n = 15), 1 mg/ml (n = 15), 0,1 mg/ml (n = 11) и 0,01 mg/ml (n = 7). Контролната група (n = 15) включваше кученца, които бяха само заразени. Кученцата се проверяват ежедневно за признаци на диария, които включват разхлабени изпражнения при леко палпиране на корема или намазана опашка през шестте дни от експеримента. Резултатните мерки са разпространение на диария (дефинирано като процент на малките с диария ежедневно) и продължителност на диарията (определено като време в дни с диария).

Статистика

Тестът на хи-квадрат (софтуер Epi Info, версия 3.4, 2005) е използван за сравняване на дела на малките с диария след RRV предизвикателство и лечение с различни концентрации на IgY. Продължителността на диарията сред малките с различни интервенции е сравнена с еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), а тази между две групи е сравнена чрез t-тест на Student (софтуер SPSS, версия 10 Windows).

РЕЗУЛТАТИ

Пероралното инокулиране на RRV обикновено предизвиква диария 24 часа след инокулацията с връх на заболяването около ден 3 до ден 4. Може да се наблюдава положителен резултат от терапевтичното хранене с IgY и явна зависимост от дозата. Тествани са четири различни дози IgY от 0,01 mg/ml до 10 mg/ml. Храненето с по-високи дози IgY (1 mg/ml) имаше по-силен ефект върху разпространението на диарията на 4-ия ден (33% срещу 67% за контрола, p = 0,006). Благоприятният ефект е по-изразен при малките, получаващи дозата от 10 mg/ml на ден 4 (6% срещу 67% за контрол, р = 0,0006). Храненето с по-ниски дози не води до значителен ефект върху разпространението на диарията (63% за 0,1 mg/ml и 86% за 0,01 mg/ml в сравнение с 67% за контролите, p = NS) (Таблица (Таблица 1 1).

маса 1

Терапевтичен ефект на различни дози орално прилаган IgY срещу RRV-индуцирана диария при бебешки мишки

Ден 1 Ден 2 Ден 3 Ден 4 Група за лечение Не. (%) с диария (%) с диария (%) с диария (%) с диария
IgY 10 mg/ml (n = 15)3 (20)5 (33)4 (27)1 (6)
IgY 1 mg/ml (n = 15)4 (27)7 (47)6 (40)5 (33)
IgY 0,1 mg/ml (n = 11)2 (18)5 (45)7 (63)7 (63)
IgY 0,01 mg/ml (n = 7)05 (71)3 (43)6 (86)
RRV (контрол) (n = 15)8 (53)13 (87)12 (80)10 (67)
IgY 10 mg/ml спрямо контрола: Ден 1: х2 = 3,6, р = 0,06, RR 0,12 (95% CI 0,38-1,15); Ден 2: х2 = 8,9, р = 0,003, RR 0,38 (95% CI 0,18-0,81); Ден 3: х 2 = 8,6, р = 0,003, RR 0,50 (95% CI 0,39-0,65); Ден 4: χ 2 = 11,6, p = 0,0006, RR 0,10 (95% CI 0,1-0,69)
IgY 1 mg/ml спрямо контрола: Ден 1: х2 = 2,2, р = 0,13, RR 0,05 (95% CI 0,32-1,85); Ден 2: х 2 = 5,4, р = 0,020, RR 0,54 (95% CI 0,30-0,96); Ден 3: х 2 = 5,0, р = 0,025, RR 0,50 (95% CI 0,26-0,98); Ден 4: χ 2 = 3,3, p = 0,06, RR 0,50 (95% CI 0,22-1,1)

CI = доверителен интервал; IgY = жълтъчен имуноглобулин; RR = Относителен риск; RRV = Rhesus rotavirus

Таблица 2

Намаляване на продължителността на индуцирана от ротавирус диария при малки кученца след перорално приложение на различна концентрация на анти-ротавирусен IgY *