РЕЗЮМЕ

Постоянната колонизация на човешкия стомах с Helicobacter pylori е рисков фактор за стомашен аденокарцином, а индуцираната от H. pylori канцерогенеза зависи от действията на бактериален онкопротеин, известен като CagA. Епидемиологичните проучвания показват, че високият хранителен прием на сол също е рисков фактор за рак на стомаха. За да изследваме ефектите от диета с високо съдържание на сол, заразихме монголски гербили с щам cagA + H. pylori от див тип (WT) или мутантен щам изогенен cagA и поддържахме животните на редовна диета или диета с високо съдържание на сол. На 4 месеца след инфекцията стомашен аденокарцином е открит при 100% от заразените с WT животни/диети с високо съдържание на сол, 58% от заразените с WT/животни с редовно хранене и нито едно от животните, заразени с мутантния щам cagA (P + Щамове на H. pylori.

високият

ВЪВЕДЕНИЕ

Helicobacter pylori е Грам-отрицателна бактерия, която присъства в половината от световното население и постоянно колонизира човешкия стомах въпреки силния имунен отговор (1–3). Въпреки че повечето заразени с H. pylori лица остават безсимптомни, присъствието на този организъм в стомаха увеличава риска от стомашен аденокарцином (4, 5) и H. pylori е класифициран като канцероген от клас I (6). Клиничните резултати от инфекцията с H. pylori се определят от различни фактори, включително генетика на гостоприемника, фактори на околната среда (включително диета) и вариация между щамовете на H. pylori в експресията на детерминанти на вирулентност (4, 5, 7).

Сред клиничните изолати на H. pylori има висока степен на генетично разнообразие (8, 9). Една от специфичните за щама генетични характеристики, свързани с неблагоприятен клиничен резултат, е 40-kb регион на хромозомна ДНК, известен като остров за патогенност на cag (PAI). Cag PAI кодира „бактериален онкопротеин“, известен като CagA и система за секреция от тип IV (T4SS), която доставя CagA в клетки гостоприемници (10–12). При транслокация в клетки гостоприемник, CagA взаимодейства с различни целеви молекули на гостоприемни клетки, което води до плейотропни ефекти, които включват пренареждане на цитоскелета, активиране на NFκB, промяна на плътните връзки и смущения в трафика на желязо (10, 13-16).

Експресията на cagA се регулира в отговор на промени в няколко условия на околната среда, включително концентрация на желязо, рН и концентрация на сол (17–20). Все още не са напълно разбрани молекулярните механизми, чрез които се регулира cagA, но е известно, че регулаторът на поглъщане на железа Fur модулира експресията на cagA (21). В отговор на повишените концентрации на сол, експресията на cagA е увеличена при някои щамове на H. pylori, но не и при други (20). При анализ на клинични щамове на H. pylori от колумбийски пациенти, способността на щамовете да регулират експресията на cagA в отговор на състояния с високо съдържание на сол е зависела от наличието на две копия на мотив TAATGA в промоторната област на cagA (22). Специфичните за щама вариации в cagA последователностите (15, 23), нивата на базалната експресия на cagA (24) и регулирането на експресията на cagA в отговор на условията на околната среда (22) могат да повлияят на степента на медиирани от CagA клетъчни промени, причинени от отделни H щамове pylori.

Епидемиологичните проучвания показват, че инфекцията с H. pylori и високият хранителен прием на сол увеличават риска от рак на стомаха при хора (25–30). Няколко проучвания са оценили ефектите от диета с високо съдържание на сол върху инфекция с H. pylori и рак на стомаха при животински модели (31–37). Едно проучване съобщава, че високата хранителна консумация на сол увеличава честотата на рак на стомаха в химически индуциран модел на канцерогенеза (33), а друго проучване съобщава, че инфекцията с H. pylori и диетата с високо съдържание на сол могат независимо да предизвикат атрофичен гастрит и чревна метаплазия в монголски гербили (34). Други проучвания съобщават, че високият прием на сол може да модулира колонизацията на H. pylori в стомаха или да промени Th2 отговорите, но общите резултати от заболяването не са били засегнати от комбинацията от инфекция с H. pylori и увеличения прием на диетична сол (35–37). Адаптиран към мишки H. pylori щам-1 (SS1) е използван в много от тези предишни проучвания. Наскоро беше съобщено, че този щам има нефункционален остров за патогенност на cag (PAI) (38, 39); следователно експериментите с този щам не позволяват оценка на cag PAI-зависимите ефекти.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Бактериални щамове и условия на култивиране. Щам 7.13 на H. pylori е използван като родителски щам от див тип (WT) за тези експерименти. Изогенен cagA мутантен щам, различен от подобни мутанти, използвани в предишни проучвания (14, 41), е конструиран чрез вмъкване на канамицинова резистентна касета (aphA) в уникално NdeI място, съответстващо на нуклеотид 1067 в cagA от щам 7.13, използвайки описаното по-рано методология (42). Щамовете на H. pylori са отгледани върху триптични плочи от соев агар, съдържащи 5% овча кръв или в бульон от бруцела (Thermo-Fisher), допълнен с 5% фетален говежди серум при 37 ° C, или в околния въздух, съдържащ 5% CO2, или в микроаеробна атмосфера, генерирана от система за контейнери BD GasPak EZ Campy. За селекция на изогенни cagA мутанти, плаките с кръвен агар бяха допълнени с канамицин (40 μg/ml). Инсерционното инактивиране на cagA е потвърдено чрез PCR и Western blot анализи.

Оценка на бактериалната тежест в стомаха на гербилите. Стомашната тъкан на Gerbil се изолира, претегля, хомогенизира в стерилен бульон от бруцела и се поставя в серийни разреждания върху плочи от соев агар Trypticase, съдържащи 5% овча кръв (лаборатории Hemostat), ванкомицин (Sigma-Aldrich) (20 μg/ml), налидиксинова киселина ( Sigma-Aldrich) (10 μg/ml), бацитрацин (Sigma-Aldrich) (30 μg/ml) и амфотерицин B (Sigma-Aldrich) (2 μg/ml) за избор на растеж на H. pylori. Тези плаки се инкубират при 37 ° С в микроаеробна камера (BD GasPak EZ Campy контейнерна система) в продължение на 5 дни. Бактериалното натоварване се изчислява чрез определяне на броя на наличните CFU на грам тъкан.

Имунохистохимично откриване на Н, К-АТФаза. Стомашната тъкан се третира с цитратен буфер (рН 6.0) при 105 ° С за 20 минути с 10 минути охлаждане преди блокиране с миши имуноглобулин (Vector Laboratories) за 60 минути. След гасене с 0,03% водороден пероксид, съдържащ натриев азид и блокиране с безсерумен протеин, се добавя първично антитяло към миши водород калиев ATPase (H, K-ATPase; Abcam) и реакционната смес се инкубира в продължение на 60 минути. Откриването на първичното антитяло се извършва с EnVision + белязана полимерна система и хромоген 3,3'-диаминобензидин тетрахидрохлорид (DAB) реагент (Dako-Agilent) преди да се извърши анализ чрез светлинна микроскопия. Секциите бяха оценени по заслепен начин от патолог по скала от 0 до 3. Резултат „0“ показва нормално разпределение на теменните клетки (без загуба на париетални клетки), „1“ показва неравномерно разпределение и лека загуба на париетални клетки, „2“ означава умерена загуба на париетални клетки, а „3“ означава пълна или почти пълна загуба на париетални клетки, както е определено в множество полета.

Статистически анализи. Плътността на бактериалната колонизация се нормализира чрез лог трансформация преди анализ с използване на несдвоен t-тест на Student. Хистологичните резултати на различни групи животни бяха сравнени с помощта на U-теста на Mann-Whitney. Ефективността на колонизацията и скоростта на дисплазия или аденокарцином при различни групи животни бяха сравнени чрез точния тест на Fisher. Корелацията между стойностите на pH на стомаха и възпалението е оценена чрез коефициента на корелация на Pearson. Резултатите от генната експресия бяха анализирани чрез несдвоен t-тест на Student и дисперсионен анализ (ANOVA). Всички статистически анализи бяха извършени със софтуерния пакет GraphPad Prism.

РЕЗУЛТАТИ

Колонизация на H. pylori на стомаха на гербилите. Гербили са заразени с WT H. pylori или изогенен мутантен щам cagA и се поддържат или на редовна диета, или на диета с високо съдържание на сол. На 16 седмици след инфекцията стомахът се отстранява, хомогенизира и се поставя върху бактериологична хранителна среда. Бактериалното натоварване се изчислява чрез определяне на броя на CFU на грам тъкан. Пунктираната линия показва границата на откриване. Данните представляват средните стойности ± стандартни грешки на средните стойности (SEM) за всяка група (n = 19 до 20 животни на група).

Имунохистохимичен анализ на стомашна Н, К-АТФаза в тъкан от стомашно тяло на заразени с H. pylori gerbils. (А) Париетални клетки в неинфектиран контролен стомах. (B) Инфектирано с WT животно, поддържано на редовна диета, показва неравномерно разпределение и умерена загуба на париетални клетки. (C) Инфектирано с WT животно, поддържано на диета с високо съдържание на сол, показва значителна загуба на париетални клетки. (D) Загубата на париетални клетки се отчита при две групи заразени животни (5 животни на група; лентите показват средно ± SEM). Резултат „0“ показва липса на загуба на париетални клетки; нормално разпределение в корпуса и антрала, „1“ показва неравномерно разпределение и лека загуба на париеталните клетки, „2“ показва умерена загуба на париетални клетки, а „3“ показва пълна или почти пълна загуба на париетални клетки в стомашната тъкан . Животните, заразени с WT H. pylori и поддържани на диета с високо съдържание на сол, показват значително увеличена загуба на париетални клетки в сравнение с инфектирани с WT животни на редовна диета (P = 0.0463, анализ на Mann-Whitney U).

Хипохлорхидрията се свързва с повишено стомашно възпаление и дисплазия. След това анализирахме дали има връзка между стомашното рН и тежестта на стомашното възпаление. При комбиниран анализ на всички животни, включени в това проучване (включително неинфектирани животни, заразени с WT животни и заразени с мутант cagA животни както при високо съдържание на сол, така и при редовни диети), има значителна връзка между стомашното рН и тежестта на стомашното възпаление (Фиг. 4Б) (Р-заразени с H. pylori животни с тежко стомашно възпаление и дисплазия, отколкото при заразени с H. pylori животни, които нямат тези характеристики.

Експресията на cagA се засилва при гербили, поддържани на диета с високо съдържание на сол. Тъй като предишни in vitro проучвания показаха, че производството на онкогенна ефекторна молекула CagA от H. pylori се регулира положително в отговор на повишени концентрации на натриев хлорид (20, 22), предположихме, че подобно повишаване на експресията на cagA може да се случи и in vivo в отговор на повишен прием на хранителна сол. За да проверим тази хипотеза, определихме количествено бактериалната експресия на cagA в стомаха на гербилите, както е описано в Материали и методи. Значително увеличение на експресията на cagA се наблюдава при инфектирани с WT животни, поддържани на диета с високо съдържание на сол, в сравнение с инфектирани с WT животни, поддържани на редовна диета (P H. pylori се култивира in vitro в присъствието на условия с високо съдържание на сол (20 Също така забелязахме, че експресията на cagA се увеличава in vivo в сравнение с експресията, наблюдавана in vitro, което е в съответствие с резултатите, съобщени по-рано (49).

ДИСКУСИЯ

В този доклад ние показваме в модел на монголски гербил, че високият прием на диетична сол засилва канцерогенезата, предизвикана от H. pylori. Наблюдаваните ефекти на високосолената диета върху индуцирания от H. pylori рак на стомаха в модела gerbil корелират добре с човешки епидемиологични данни, които многократно показват повишен процент на рак на стомаха при лица, които консумират диета с високо съдържание на сол (25–30 ). Диетата с високо съдържание на сол, използвана в това проучване (8,75% натриев хлорид), приближава концентрацията на натриев хлорид в някои храни, консумирани от хората. Например сушената риба често се консервира в 3 до 20% сол, маринованите храни съдържат до 25% сол, а соевият сос съдържа 19% сол (35). За разлика от диетата при хора, която варира значително от ден на ден, гербилите в това проучване са били хранени с диета с високо съдържание на сол, без вариации за продължителен период от време.

В настоящото проучване ние забелязахме, че сред гербили, заразени с щама WT и хранени с редовна диета, ракът на стомаха е бил наличен на 4 месеца след инфекцията при 60% от животните. Тази честота на рак на стомаха в модела на гербили е подобна или малко по-висока от тази, съобщена в няколко предишни проучвания (18, 40, 41). Ракът на стомаха се развива при животни, които са били заразени с щам WT cagA + H. pylori, но не и при животни, заразени с изогенен мутант щам cagA. Въпреки че не анализирахме допълнен мутантен щам в настоящото проучване, неуспехът на мутантния щам cagA да причини рак на стомаха съответства на резултатите от няколко други проучвания (18, 41). Колективно тези резултати в животински модели на инфекция с H. pylori, съчетани с доказателства от трансгенни експерименти с животни (50), експерименти с клетъчни култури (16) и епидемиологични проучвания при хора (51), предоставят доказателства, че CagA има важна роля при рак на стомаха патогенеза.

Прилагането на диета с високо съдържание на сол върху незаразени животни не стимулира развитието на рак на стомаха, което ни кара да заключим, че ефектите от диетата с високо съдържание на сол върху рака на стомаха зависят от наличието на инфекция с H. pylori. Забелязваме по-специално, че диетата с високо съдържание на сол води до повишена честота на стомашен карцином при животни, заразени с щам WT cagA + H. pylori, но не и при животни, заразени с мутант щам cagA. Това предоставя доказателства, че ефектите от диетата с високо съдържание на сол върху патогенезата на рака на стомаха са от значение главно в контекста на инфекция с щамове cagA + H. pylori. Не са ни известни проучвания, които са изследвали връзките между диета с високо съдържание на сол, инфекция с щамове cagA + H. pylori и рак на стомаха при човешки популации, но в няколко части на света, които имат висок процент на рак на стомаха, има е високо разпространение на щамове cagA + и голяма част от населението консумира диета с високо съдържание на сол.

Няколко предишни проучвания са анализирали ефекта на диетата с високо съдържание на сол (обикновено 8% добавена сол, подобно на настоящото проучване) върху индуцираната от H. pylori стомашна патология при животински модели, но не са стигнали до последователно заключение (31–37). За отбелязване е, че проучванията върху гризачи в много от тези доклади са проведени с помощта на H. pylori Sydney Strain 1 (SS1), който съдържа неактивен cag PAI (38, 39). Предлагаме, че ефектът от диетата с високо съдържание на сол на индуцирания от H. pylori рак на стомаха може да бъде по-лесно откриваем при експерименти, при които се използва щам cagA + и модел на джербил.

В допълнение към диетата с високо съдържание на сол, наскоро беше показано, че диетата с ниско съдържание на желязо увеличава индуцираната от H. pylori канцерогенеза в модела на гербили (18). Условията с ниско съдържание на желязо водят до промени в експресията на много гени на H. pylori, включително повишаване на експресията на cagA (17), а също така стимулират сглобяването на пили, свързани с cag T4SS, когато H. pylori е в контакт със стомашните епителни клетки (18 ). Потенциално има свързани характеристики на тези две различни диетични интервенции, които водят до повишена вирулентност на H. pylori или прогресиране на болестта на гостоприемника. Например, абсорбцията на желязо може да бъде нарушена в условията на хипохлорхидрия (52–54).

Предишни проучвания съобщават, че излагането на H. pylori на условия на високо съдържание на сол in vitro води до промени в експресията на множество гени на H. pylori, включително cagA (22). В настоящото проучване наблюдавахме, че експресията на cagA ген е повишена в стомаха на WT-заразени животни, поддържани на диета с високо съдържание на сол, в сравнение с заразени с WT животни, поддържани на редовна диета (когато се нормализира въз основа на сравнение с 16S rRNA). Това регулиране на транскрипцията на cagA в отговор на диета с високо съдържание на сол имитира регулирането на експресията на cagA ген, което се наблюдава in vitro в отговор на състояния с високо съдържание на сол. В съгласие с предишен доклад (49), също така забелязахме, че cagA транскриптите са по-богати в пробите от стомашната тъкан, отколкото в бактериите, отглеждани в лабораторна среда. Предлагаме, че повишеното регулиране на експресията на cagA ген в отговор на диетата с високо съдържание на сол е важна характеристика на механизма, чрез който диетата с високо съдържание на сол засилва канцерогенезата.

Наблюдавахме, че животните, заразени с щама WT и хранени с високосолена диета, имат значително по-високи нива на стомашно възпаление, отколкото заразените с WT животни на редовна диета. За да изясним потенциална имунологична основа за тази разлика, ние анализирахме експресията на няколко цитокини, хемокини и имуномодулиращи молекули, които регулират възпалението. Този анализ е ограничен по обхват, тъй като реагентите и последователностите не са лесно достъпни за имунологични изследвания при гербили. Независимо от това успяхме да докажем, че относителните нива на експресия на IFN-γ, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-10, KC, iNOS и CCL12 бяха увеличени при заразени с WT H. pylori животни в сравнение с незаразените животни. Интересното е, че както транскрипцията на IL-1β, така и транскрипцията на iNOS са значително повишени при заразените с WT гербили, поддържани на диета с високо съдържание на сол, в сравнение с редовните диети, което предполага, че тези фактори могат да допринесат за повишеното възпаление, придружаващо високо съдържание на сол диета.

В обобщение, резултатите от това проучване разкриват, че повишената консумация на диетична сол значително променя резултата от инфекцията с щам cagA + H. pylori. В най-простия модел високите концентрации на сол стимулират повишена експресия на cagA, а действията на CagA водят до възпаление, хипохлорхидрия и засилена канцерогенеза. Също толкова правдоподобен модел предлага високите концентрации на сол да доведат до променена експресия на множество гени на H. pylori (включително cagA) (22), както и до промени в гостоприемника и че това съзвездие от изменения стимулира засилената канцерогенеза. Независимо кой механизъм е действащ, настоящите резултати се сравняват благоприятно с голям брой епидемиологични доказателства, сочещи, че диетата с високо съдържание на сол е рисков фактор за рак на стомаха при хората (25–30). Потенциално намаляването на приема на диетична сол може да доведе до намаляване на риска от асоцииран с H. pylori стомашен аденокарцином при популации, които имат висок риск от това злокачествено заболяване.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа бе подкрепена отчасти от NIH AI068009 (T.L.C.), CA116087 (T.L.C.), F32 AI102568 (J.A.G.), R01 DK58587 (R.M.P.), R01 CA77955 (R.M.P.) и Министерството на ветераните (T.L.C.) и H.M.S.A. Тази работа беше подкрепена и от Центъра за рак на Vanderbilt Ingram, а основните услуги, извършвани чрез Центъра за изследване на храносмилателните заболявания на Университета на Вандербилт, бяха подкрепени от безвъзмездната помощ на NIH P30DK058404.

Благодарим на Джуди Ромеро-Гало и Джени Ното за полезни съвети относно модела на гербилите.