Григорий А. Принц

Virion Systems, Inc., Роквил, Мериленд, 1 и Катедра по педиатрия, Медицински факултет на Ф. Едуард Хеберт, Университетски университет за здравни науки, Бетесда, Мериленд, 20814, 2 и Департамент по педиатрия, Медицинско училище в Маунт Синай, Ню Йорк, Ню Йорк 10029 3

Мартин Г. Отолини

Virion Systems, Inc., Роквил, Мериленд, 1 и Катедра по педиатрия, Медицински факултет на Ф. Едуард Хеберт, Университетски университет за здравни науки, Бетесда, Мериленд, 20814, 2 и Департамент по педиатрия, Медицинско училище в Маунт Синай, Ню Йорк, Ню Йорк 10029 3

Ан Москона

Virion Systems, Inc., Роквил, Мериленд, 1 и Катедра по педиатрия, Медицински факултет на Ф. Едуард Хеберт, Университетски университет за здравни науки, Бетесда, Мериленд, 20814, 2 и Департамент по педиатрия, Медицинско училище в Маунт Синай, Ню Йорк, Ню Йорк 10029 3

Резюме

Семейството Paramyxoviridae се състои от няколко важни агента на човешката патология, включително морбили, паротит, дихателни синцитиални и човешки парагрипни вируси. Човешкият парагрипен вирус тип 3 (HPF3) е втората водеща причина за респираторни заболявания при кърмачета и деца и понастоящем няма налична ваксина или антивирусна терапия за този агент.

Опаковката на HPF3 съдържа два вирусни гликопротеина, протеина хемаглутинин-невраминидаза (HN) и сливания (F) протеин. Инфекцията на клетките с HPF3 се инициира чрез прикрепване на вируса към клетката гостоприемник чрез взаимодействие на HN гликопротеина със съдържащ сиалова киселина рецептор на клетъчната повърхност. Проникването и освобождаването на вируса е резултат от F-протеиново медиирано сливане на вирусната обвивка с плазмената мембрана на клетката, което води до освобождаване на вирусния нуклеокапсид в цитоплазмата. За да се получи сливане, са необходими както взаимодействие на вирусния HN гликопротеин с неговия рецептор за сиалова киселина, така и присъствието на вирусния F гликопротеин (5, 6, 8, 11, 12). По силата на своята невраминидазна активност, HN има и потенциал за разрушаване на рецепторите, който играе роля в разпространението на инфекцията (7).

Отличителният цитопатичен ефект на острата инфекция с HPF3 in vitro е широкото клетъчно сливане, което води до образуване на синцитий, което включва взаимодействието на F и HN протеини, изразени на повърхността на заразена клетка, с мембраната на съседна незаразена клетка. В предишно проучване бяха изолирани варианти на HPF3 вируси, които имат значително повишена способност да сливат клетки в култура; това предлага нов подход за разбиране на механизма на индуцирано от парамиксовирус клетъчно сливане и ролята на HN протеина в този процес. Двата силно фузогенни варианта на HPF3, които бяха изолирани, C-0 и C-22, показаха повишена авидиция към рецепторите на сиалова киселина поради промени в единични аминокиселини в HN протеина (12). Тези проучвания демонстрират, че ключов компонент на функцията на HN за насърчаване на сливането в клетъчната култура е неговата авидност на свързване със съдържащи сиалова киселина рецептори.

Продължавайки да изследваме ролята на невраминидазата в жизнения цикъл и патогенезата на HPF3, изолирахме вариант на HPF3 (C-28), който има намалена активност на невраминидазата спрямо тази на дивия тип (тегло) (7). Анализът на растежните свойства на този вариант разкрива забавяне (от 7 часа) в освобождаването на вирусни частици в супернатантата; добавянето на екзогенна невраминидаза към културата коригира това забавяне. Тези констатации са включили активността на невраминидазата на HN в освобождаването на HPF3 вирусни частици от повърхността на заразената клетка, като по този начин започва нов кръг на инфекция (7).

Използване на рецептор-свързващи и невраминидазни варианти на HPF3 при памучен плъх.

Също така установихме дали невраминидазната активност на HN, която е критична за резултата от инфекцията в клетъчната култура, е определяща за резултата от инфекцията в белия дроб, като използвахме вариант С-28, който има 40% от теглото на невраминидазната активност ( 7). С-28, без промени в последователността на F протеина, има едноточкова мутация в HN протеина, т.е. мутация G-to-A на нуклеотид 724, която превръща аспарагинова киселина 216 в аспарагин. C-28 показва първоначално забавяне на растежа в клетъчната култура поради бавно освобождаване, но след това наваксва и причинява по-широко сливане, отколкото теглото. Повишената фузогенност на C-28 се дължи на ниската му активност на невраминидаза, която оставя на разположение повече клетъчни рецептори на сиалова киселина за свързване на HN.

Вирусна репликация.

Инбредни млади възрастни памучни плъхове (Sigmodon hispidus) от двата пола са получени от размножителната колония на Virion Systems, Inc., настанени в големи поликарбонатни клетки и хранени с диета от стандартна чау и вода с гризачи. Животните са серонегативни за случайни парамиксовируси, RSV и други често срещани патогени на гризачи.

Плъховете са заразени интраназално със 100 μl, съдържащи две различни входни дози за всеки вирус, 10 5,5 и 10 6,5 PFU. Животните бяха умъртвени за изследване на 2, 4, 6, 8 и 10 дни след инфекцията, за да се получи времеви курс на вирусна репликация и прогресия на заболяването в белия дроб. Времевите точки бяха избрани въз основа на следната обосновка. На 2 дни след инфекцията C-22, C-0 и C-28 показват големи плаки в клетъчен монослой. Четири дни представляват пика на репликация на тегло HPF3 в белия дроб, а 6 дни е времето на пика на белодробния възпалителен отговор с тегло HPF3 (18). 8- и 10-дневните времеви точки бяха избрани в опит да се търси забавено изчистване на вариантите на вирусите.

След жертването на животните чрез вдишване на въглероден диоксид, носната и белодробната тъкан от всяко животно се разделят на две (другата половина се използва за хистологичен анализ) и се хомогенизират отделно, както е описано по-горе (18), и след това те се съхраняват при -70 ° C до анализиран. Титрите на вируса бяха определени чрез анализ на плака върху MA104 бъбречни клетки на африкански зелени маймуни и изчислени като PFU на грам тъкан.

Вирусът от див тип се репликира до титър, който е подобен или малко по-висок от този на трите варианта в белите дробове и носа (фиг. (Фиг. 1). 1). Разликите бяха най-изразени в случая на C-0, където пиковите титри бяха значително по-ниски (P ≤ 0,05, t тест на обобщени данни) от теглото на теглото в белите дробове (дни 2 и 4) и носа (ден 2) и в случая на C-22, където пиковите титри са били значително по-ниски от тези на теглото в носа (дни 2 и 4). Няма значителни разлики в кинетиката на репликация, като wt и вариантните вируси се изчистват до 6-ия ден в белите дробове и 8-ия ден в носа. Трябва да се отбележи, че за всеки от трите варианта морфологията на плаката на вариантите на вирусите се запазва in vivo, без видимо връщане към wt фенотипа. Всички плаки от вируси, получени от заразени с варианти животни, показват типичните големи, кръгли плаки, характерни за всеки вариант (7, 12).

забележка

Геометрични средни вирусни титри в белите дробове и носните тъкани от памучни плъхове на 2, 4, 6, 8 и 10 ден след инфекция с C-28, C-22, C-0 и тегло HPF3. Всяка точка представлява осем (бели дробове) или четири (носове) животни. На 2 и 4 ден някои титри за C-22 и C-0, както е посочено в текста, са били значително по-ниски (P ≤ 0,05) от тези за теглото.

Хистопатология на белодробната тъкан.

Хистопатологичните промени не корелират с вирусните титри в нито един от трите параметъра, които измерихме в белите дробове. Перибронхиолит (фиг. (Фиг. 2) 2) е видна находка и във всичките четири групи, с леки разлики (P (фиг. 2) 2) и интерстициален пневмонит (данните не са показани), докато не се наблюдават такива патологични промени от wt вируса, въпреки факта, че wt постигна по-високи титри, отколкото вариантите. Фигура Фигура 3 3 показва представителни примери за хистопатологията, която е била видяна. Фигура Фигура 3А 3А показва инфектирана с тегло белодробна тъкан с перибронхиолит, но нито алвеолит, нито интерстициален пневмонит. Фигура Фигура 3В 3 В показва алвеоларна тъкан от инфектирана с тегло белодробна тъкан без данни за заболяване. Фигура Фигура 3С 3 С показва белодробна тъкан, заразена с вариант С-0 с перибронхиолит, която не се различава от тази, причинена от теглото. Фигура 3D 3 D показва алвеоларна тъкан от белодробна тъкан, заразена с вариант C-0, с поразителен алвеолит (клетки във въздушните пространства) и интерстициален пневмонит (удебелени алвеоларни стени).

Средноаритметични оценки на белодробната патология (плюс стандартни грешки) за тежест на перибронхиолит и алвеолит. Интерстициалният пневмонит показа същия модел като алвеолита и не е включен в тази фигура. Звездичките показват стойности, които са значително по-високи от стойностите за теглото за същия ден след инфекция. Всяка група се състоеше от осем животни.

Представителни примери за хистопатология на белодробната тъкан. (A) wt инфектирана с вирус белодробна тъкан, показваща перибронхиолит. Увеличение, × 64. (B) wt инфектиран с вирус белодроб, без данни за алвеоларна или интерстициална патология. Увеличение, × 128. (C) Белодроб, заразен с вариант С-0, показващ перибронхиолит. Увеличение, × 64. неразличим от този, причинен от wt. (D) Белодроб, заразен с вариант С-0, показващ поразителен алвеолит (клетки във въздушните пространства) и интерстициален пневмонит (удебелени алвеоларни стени).

Хистопатология на носната тъкан.

За изследване на носните тъкани, всеки череп на плъх се поставя в 10% формалин и след това се декалцифицира преди секционирането. За всяко животно бяха приготвени множество коронални секции на интервали от 1 mm. Три параметъра бяха оценени поотделно за всеки образец: увреждане на епителните клетки, епителна инфилтрация (предимно неутрофили) и ексудат (хуморален или клетъчен) в носното въздушно пространство.

Нито един от четирите вируса не е причинил значителни патологични промени в нито един от трите параметъра, които сме изследвали (данните не са показани), констатация в съответствие с по-ранни наблюдения върху теглото на HPF3 инфекция при памучни плъхове (18).

Последици от засилено заболяване, причинено от рецептор-свързващи и невраминидазни варианти на HPF3.

Вариантите C-22 и C-0 причиняват повишено сливане в клетъчната култура поради повишената авидност на HN за неговия рецептор, съдържащ сиалова киселина (12). Установихме, че докато C-22 и C-0 нямат предимство по отношение на репликацията в белия дроб и всъщност се репликират до малко по-нисък титър от wt вируса, те причиняват засилена патология. По този начин промененият HN, с повишена авидност за неговия рецептор, е определящ фактор за патогенезата в белия дроб.

C-28 има само приблизително 40% от активността на невраминидазата на тегл. HPF3, причинявайки първоначално забавяне на растежа поради бавно освобождаване от повърхността на заразената клетка. Освобождаването на варианта C-28 в крайна сметка настига теглото, тъй като натрупаните вириони позволяват адекватна активност на невраминидазата. Друга характеристика на този вариант е, че той причинява по-широко сливане в клетъчната култура, отколкото теглото, тъй като по-ниската активност на невраминидазата оставя повече рецептори на разположение в съседните клетки за взаимодействие с HN. Следователно беше от голям интерес да се определи дали този вирус причинява по-малко болести поради първоначалното изоставане в растежа или неговата по-висока фузогенност, наблюдавана в клетъчната култура, води до по-тежко заболяване в белия дроб.

Предполага се, че за грипния вирус активността на невраминидазата може да бъде важна за отстраняване на муциновите сиалови киселини от дихателните пътища, позволявайки на вируса да достигне целевите си клетки (1). Докато изследванията с използване на мутант на грипен вирус с дефицит на невраминидаза показват, че невраминидазната функция не е абсолютно необходима за репликация в дихателните пътища на мишки (10), възможно е такъв механизъм да допринася за патогенезата. Съществува прецедент за намалена вирулентност в резултат на намалена активност на невраминидазата за грипни вируси при животни (16, 26). Следователно беше възможно C-28 да е по-малко вирулентен от теглото на HPF3. В допълнение към гореспоменатата възможност, забавянето на освобождаването на потомството на вируса C-28 от повърхността на гостоприемника може да попречи на разпространението на вируса в нови клетки в белия дроб, като по този начин предотврати тежко заболяване. Нашите открития тук обаче показват, че C-28, с HN мутация, причиняваща дефицит на невраминидаза, е свързан с засилена патология.

Възможността, че балансът между рецептор-свързващите и невраминидазните дейности може да бъде от решаващо значение за жизнения цикъл на HPF3, се предполага от няколко реда доказателства. По-рано беше показано (13), че нивото на невраминидаза определя дали резултатът от HPF3 инфекция в културата ще бъде остра инфекция с клетъчно сливане или персистираща инфекция без клетъчно сливане. Други проучвания показват, че под селективното налягане на екзогенната невраминидаза, присъстваща в заразена клетъчна култура, която служи за отстраняване на част от наличните рецептори на сиалова киселина, се появяват два различни типа вирусни варианти: (i) варианти с намалена невраминидаза (7) и (ii) варианти с повишена склонност към свързване с рецепторите (12, 14). Фактът, че и двата типа варианти се появяват под един и същ селективен натиск на рецепторния недостиг, предполага, че промяната във всяка функция може да компенсира недостига на рецептори.

Изследването на вариант на чувствителен към температурата вирус на Нюкасълска болест (NDV) и два последователни ревертиращи вируса разкриха, че промените в невраминидазата могат да компенсират промените в свързването (24, 25). Оригиналният вариант на NDV, със заместване на аминокиселина в позиция 129, е дефицитен в свързващите еритроцити; втора мутация, в позиция 175, намалена активност на невраминидазата, но възстановено свързване; третата последователна мутация, в позиция 193, частично възстановена активност на невраминидазата. Тази последователна еволюция предполага, че балансът между двете дейности е определящ за селективното предимство и оцеляването. Докато наскоро определената кристална структура на NDV (2) предполага, че каталитичната и свързваща функция на HN се намират в едно място, други данни показват, че е възможно отделните мутации да повлияят на една функция, без да засягат другата (17).

Инфекцията C-28 на памучни плъхове в това проучване осветява въпроса дали HPF3 невраминидазата има роля, пряка или непряка, в HPF3 патогенезата. Резултатите предполагат, че дефицитът на C-28 HN в невраминидазата не причинява изразени дефекти в способността за репликация на вируса, но причинява по-интензивно заболяване в белия дроб. Ще бъде от голям интерес да се тества наскоро характеризиран вариант, който е напълно дефицитен на невраминидаза; докато C-28 има 40% от теглото си активност на невраминидаза, този вариант е напълно дефицит на невраминидаза, но е в състояние да се свързва и влиза ефективно в клетките (17).

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездната помощ за обществено здравеопазване AI 31971 на A.M. от Националните здравни институти.

Благодарим на Ричард Пелусо и Олга Грингард за полезни дискусии.