Тонг Джоу

1 Провинциална ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Ю-Жи Джан

1 Ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Dong-Ping Xu

1 Провинциална ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Fang Wang

1 Провинциална ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Юе Джоу

1 Провинциална ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Jie Zheng

1 Ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Я Ли

1 Ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Дзяо-Дзяо Жанг

1 Провинциална ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

Хуа-бин Ли

1 Провинциална ключова лаборатория за храни, хранене и здраве в провинция Гуангдонг, Училище за обществено здраве, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510080, Китай

2 Южнокитайски морски биоресурсен център за съвместна иновация, експлоатация и използване, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу 510006, Китай

Резюме

Хроничната прекомерна консумация на алкохол (повече от 40–80 g/ден за мъже и над 20–40 g/ден за жени) може да предизвика сериозно увреждане на черния дроб. В това проучване бяха оценени ефектите на лимоновия сок върху хронично увреждане на черния дроб, причинено от алкохол при мишки. Серумните биохимични профили и нивата на чернодробна липидна пероксидация, съдържанието на триацилглицерол (TG), антиоксидантните ензимни активности и хистопатологичните промени бяха изследвани за оценка на хепатопротективните ефекти на лимоновия сок при мишки. Освен това бяха определени in vitro антиоксидантните способности на лимоновия сок. Резултатите показаха, че лимоновият сок значително инхибира индуцираното от алкохол повишаване на нивата на аланин трансаминаза (ALT), аспартат трансаминаза (AST), чернодробна TG и липидна пероксидация в зависимост от дозата. Хистопатологичните промени, предизвикани от алкохола, също бяха значително подобрени чрез лечение с лимонов сок. Тези открития показват, че лимоновият сок има защитен ефект върху алкохолно увреждане на черния дроб при мишки. Защитните ефекти могат да бъдат свързани с антиоксидантната способност на лимоновия сок, тъй като лимоновият сок показва in vitro антиоксидантна способност.

1. Въведение

Злоупотребата с алкохол и алкохолизмът могат да доведат до сериозни здравословни и социално-икономически проблеми в световен мащаб. Хроничната прекомерна консумация на алкохол (повече от 40–80 g/ден за мъже и над 20–40 g/ден за жени) може да доведе до няколко заболявания, като стомашно-чревно увреждане, панкреатит, алкохолно чернодробно заболяване, неврологични нарушения, захарен диабет, и рак [1, 2]. Сред тези заболявания алкохолната чернодробна болест привлича по-голямо внимание поради високата си заболеваемост и смъртност. Алкохолното чернодробно заболяване е основен тип хронично чернодробно заболяване в целия свят и може да прогресира до чернодробна цироза и рак на черния дроб.

Хроничната консумация на алкохол може да генерира изобилие от реактивни кислородни видове (ROS), включително радикал на супероксиден анион (O2 - •), хидроксилен радикал (OH •) и водороден пероксид (H2O2). ROS може да реагира с повечето клетъчни макромолекули и впоследствие да причини клетъчно увреждане [3]. Следователно, прекомерната ROS, предизвикана от алкохол, се счита за важен фактор за развитието на алкохолно увреждане на черния дроб. Различни ензимни и неензимни антиоксиданти са свързани със защитата на клетките срещу ROS. Антиоксидантните ензими включват каталаза (CAT), супероксиддисмутаза (SOD) и глутатион пероксидаза (GPx), а неензимните антиоксиданти включват глутатион (GSH), витамин Е, аскорбат, витамин А и убихинон [4]. Неензимните антиоксиданти могат да бъдат засилени чрез прием на антиоксиданти. През последните години се съобщава, че много природни продукти, които имат изобилие от антиоксиданти, притежават ефекта на изчистване на свободните радикали и защита на черния дроб от окислително увреждане [4, 5].

Лимонът е популярен плод, консумиран като сок и съдържа високо съдържание на витамини и полифеноли (главно флавоноиди), като хесперидин, ериоцитрин, нарингин, неохесперидин, рутин кверцетин, хлорогенова киселина, лутеолин и кемпферол [6]. Експериментите in vivo и in vitro показват, че лимонът има различни ползи за здравето, като противораков ефект, антимикробен ефект, понижаващ липидите ефект и защитен ефект срещу сърдечно-съдови заболявания [6]. Освен това лимонът се използва за лечение на чернодробни заболявания в племенната медицина [7]. В литературата обаче не са докладвани ефекти на лимонов сок върху хронично увреждане на черния дроб, причинено от алкохол. Целта на това проучване е да се изследват ефектите на лимоновия сок върху хроничното алкохолно увреждане на черния дроб при мишки. Освен това бяха оценени in vitro антиоксидантните способности на лимоновия сок. Резултатите от това проучване могат да предоставят ценна информация за широката общественост за намаляване на вредата от консумацията на алкохол.

2. Материали и методи

2.1. Химикали и реактиви

Съединенията 6-хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксилна киселина (Trolox), 2,2′-азинобис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) диамониева сол (ABTS), 2,4, 6-три (2-пиридил) - S-триазин (TPTZ), кверцетин, галова киселина и фенолният реагент на Folin – Ciocalteu са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, МО, САЩ). Комплекти за анализ за определяне на SOD, липидна пероксидация, CAT и TG съдържания са закупени от Института по биоинженерия Nanjing Jiancheng (Nanjing, Китай). Други химикали са с аналитичен клас.

2.2. Материали

Лимонът е получен от пазари в Гуанджоу, Китай. Плодовете се почистват с дейонизирана вода. Ядливата порция се претегля прецизно и се смесва с дейонизирана вода (1: 1, m/v) и сместа се смила в хомогенат с хомогенизатор. След това хомогенатът се центрофугира при 5000 g в продължение на 10 минути и се получава супернатантата. Супернатантът се използва за измерване на антиоксидантния капацитет, общото съдържание на феноли (TPC) и общото съдържание на флавоноиди (TFC) и за експерименти с животни. Нещо повече, при експерименти с животни първоначалната супернатанта и разредената супернатанта (1: 5 и 1: 10, m/v) са използвани съответно като висока, средна и ниска доза. Лимоновият сок беше прясно приготвен преди сонда всеки път.

2.3. Проучване върху животни

2.4. Измерване на биохимични параметри в серума

Нивата на ALT, AST и TG в серума се определят от автоматизиран биохимичен анализатор Hitachi-7180 ​​(Hitachi, Япония) със съответния комплект реактиви.

2.5. Измерване на активността на TG и антиоксидантните ензими в черния дроб

Нивата на TG, SOD и CAT в чернодробната тъкан са измерени с помощта на търговските комплекти за откриване в съответствие с инструкциите на производителя.

2.6. Измерване на нивата на пероксидация на липидите в черния дроб

Нивата на липидна пероксидация в чернодробната тъкан са измерени чрез метод с тиобарбитурова киселина (TBA), като се използват търговските комплекти за откриване в съответствие с инструкциите на производителя. Референтният стандарт беше малондиалдехид (MDA) и резултатите бяха изразени като nmol MDA еквивалент/mg prot.

2.7. Хистопатологична оценка на черния дроб

Чернодробната тъкан, фиксирана в 4% параформалдехид, беше вградена в парафин, разделена на 5 μm дебелина и оцветена с хематоксилин-еозин (H&E) за оценка на хистопатологичните промени. Хистопатологичните промени на оцветените чернодробни резени се наблюдават под микроскоп с ярко поле.

2.8. Тест за намаляване на железния антиоксидант (FRAP)

FRAP анализът се извършва въз основа на метода, описан в литературата [9]. Накратко, реагентът FRAP се приготвя от 10 mmol/L разтвор на TPTZ, 20 mmol/L разтвор на железен (III) хлорид и 300 mmol/L буферен разтвор на натриев ацетат (рН 3.6) в обемно съотношение 1: 1: 10, съответно. 100 μL от разредената проба се добавят към 3 ml от FRAP реагента и сместа се измерва след 4 минути при 593 nm. Стандартната крива е установена с разтвор на FeSO4 и резултатите са изразени като μmol Fe (II)/g сухо тегло на лимон.

2.9. Анализ на еквивалентната антиоксидантна способност на Trolox (TEAC)

TEAC анализът се провежда съгласно процедурата в литературата [10]. Накратко, основният разтвор ABTS • + се приготвя от 2,45 mmol/L калиев персулфат и 7 mmol/L ABTS разтвор в обемно съотношение 1: 1 и след това се поставя на тъмно за 16 h при стайна температура. Работният разтвор ABTS • + се приготвя чрез разреждане на основния разтвор и абсорбцията на ABTS • + работния разтвор е 0.710 ± 0.05 при 734 nm. 100 μL от разредената проба се смесва с 3,8 ml ABTS • + работен разтвор и абсорбцията на сместа се измерва при 734 nm след 6 минути и се изчислява процентът на инхибиране на абсорбцията при 734 nm. Референтният стандарт беше Trolox и резултатите бяха изразени като μmol Trolox/g сухо тегло на лимон.

2.10. Определяне на TPC

TPC са измерени съгласно литературата [11]. Накратко, 0,50 ml от разредената проба се добавят към 2,5 ml от 0,2 mmol/L реактив Folin-Ciocalteu. След 4 минути се добавят 2 ml наситен разтвор на натриев карбонат. След инкубация в продължение на 2 часа при стайна температура, абсорбцията на сместа беше измерена при 760 nm. Референтният стандарт беше галовата киселина и резултатите бяха изразени като mg еквивалент на галова киселина (GAE)/g сухо тегло на лимон.

2.11. Определяне на TFC

TFC са измерени съгласно литературата [12]. Накратко, 0,50 ml от пробата се смесват с 1,5 ml 95% етанол (v/v), 0,1 ml 10% алуминиев хлорид (w/v), 0,1 ml 1 mol/L калиев ацетат и 2,8 ml от вода. След инкубация в продължение на 30 минути при стайна температура, абсорбцията на сместа се определя при 415 nm. Референтният стандарт е кверцетин и резултатите са изразени като mg кверцетинов еквивалент (QE)/g сухо тегло на лимон.

2.12. Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с post hoc LSD тест, използващ софтуера SPSS 13.0. p Фигура 1, прилагането на алкохол доведе до значително (p Фигура 2 (а)). Прилагането на лимонов сок намалява натрупването на TG по зависим от дозата начин, особено при висока концентрация на група лимонов сок (p Фигура 2 (b)). Значително прилагане на средна и висока концентрация на лимонов сок (p Фигура 3. В сравнение с това на контролната група, има значително (p Фигура 4 представя резултатите от чернодробните антиоксидантни ензимни активности в пет групи. Нивото на SOD в черния дроб се е увеличило значително (р 0,05) в групата на модела в сравнение с контролната група в това проучване. Въпреки това, лечението с лимонов сок е значително (p Таблица 1 .

върху

Забележка. Контрол: нормална група; Модел: алкохолна група; LL: алкохол и ниска доза група лимонов сок; LM: алкохол и средна доза група лимонов сок; LH: алкохол и висока доза група лимонов сок. * Означава, че нивата на параметрите в групата на модела са били значително (p Фигура 5). Не е наблюдавана патологична аномалия в черния дроб на контролната група със запазена цитоплазма и отчетливо ядро, както е показано на Фигура 5 (а). На Фигура 5 (б), беше наблюдавано в моделната група, че етанол индуцира промени в некрозата и значителни малки капчици мазнини в чернодробна секция. Въпреки това, черен дроб на мишки във всички групи, третирани с лимонов сок, показва забележимо възстановяване от чернодробно увреждане, предизвикано от етанол, с по-малко промени в малките мастни капчици и некроза на хепатоцитите.

Микрофотографиите на чернодробни секции, взети от мишки. а) нормална група; б) алкохолна група; в) алкохол и ниска доза лимонов сок; (г) алкохол и средна доза група лимонов сок; (д) група алкохол и висока доза лимонов сок. Стрелката показва състояние на малки промени в капчиците мазнини, а кръгът показва некроза на хепатоцитите, която се среща главно в група алкохолни модели.

3.6. In vitro антиоксидантна активност, общо фенолно съдържание (TPC) и общо съдържание на флавоноиди (TFC) на лимонов сок

In vitro антиоксидантните активности на лимона бяха оценени с помощта на анализи за намаляване на железния антиоксидант (FRAP) и тестове за еквивалентен антиоксидантен капацитет на Trolox (TEAC). Стойностите на FRAP и TEAC са съответно 50,82 ± 2,70 μmol Fe (II)/g сухо тегло (DW) и 19,88 ± 0,66 μmol Trolox/g DW. Общото фенолно съдържание (TPC) и общото съдържание на флавоноиди (TFC) в лимона са съответно 6,21 ± 0,28 mg GAE/g DW и 0,30 ± 0,03 mg QE/g DW, съответно.

4. Дискусия

Нарушението на употребата на алкохол причинява значителни заболявания, а черният дроб е най-неблагоприятно засегнатият орган. В настоящото проучване са изследвани ефектите на лимоновия сок върху хронично увреждане на черния дроб, причинено от алкохол при мишки. Индуцирано от етанол увреждане на черния дроб при мишки се доказва чрез повишени нива на AST и ALT. Лечението с лимонов сок понижава повишените нива на AST и ALT в серума. Възстановяването на активността на аминотрансферазите (AST или ALT) в серума към нормалното показва регенерацията на хепатоцитите и заздравяването на чернодробния паренхим; следователно лимоновият сок имаше защитен ефект при алкохолно увреждане на черния дроб. Резултатите са в съгласие с предишни доклади, които показват, че лимонът притежава хепатопротективен ефект върху увреждане на черния дроб, причинено от въглероден тетрахлорид и остри физически упражнения [7, 13]. В допълнение, хроничното алкохолно увреждане на черния дроб беше допълнително потвърдено от чернодробни хистопатологични промени в настоящото проучване, а лечението с лимонов сок също значително подобри чернодробните хистопатологични промени, което допълнително потвърди хепатопротективната активност на лимоновия сок при алкохолно увреждане на черния дроб при мишки.

Чернодробната стеатоза е най-ранното заболяване на черния дроб поради хронична консумация на етанол, с характеристиката на натрупване на мазнини. Общоприето е, че при развитието на чернодробна стеатоза излагането на етанол увеличава съотношението на намален никотинамид аденин динуклеотид/окислен никотинамид аденин динуклеотид в хепатоцитите, които нарушават β-окислението на митохондриалната мастна киселина и индуцират допълнително стеатоза [15]. В това проучване причинената от алкохол поява на чернодробна стеатоза се потвърждава от повишено съдържание на TG в черния дроб и хистопатологични промени. Лечението с лимонов сок значително понижи чернодробното съдържание на TG и подобри увредените хистопатологични промени. По-специално, мишките, на които е давана висока доза лимонов сок, са се възстановили почти напълно до нормалното.

В това проучване лимоновият сок разкрива защитен ефект при хронично увреждане на черния дроб, предизвикано от алкохол. Поради факта, че лимонът съдържа разнообразни биоактивни съставки, хепатопротективният ефект може да е резултат от съвместно действие на множество механизми и е трудно да се изясни специфичният механизъм на действие. Средните in vitro антиоксидантни способности на лимона и намалените in vivo нива на MDA показват, че лимонът може да намали оксидативния стрес, предизвикан от етанола, като по този начин оказва хепатопротективни ефекти. Това проучване установи, че лимоновият сок има силен хепатопротективен ефект, който предоставя ценна информация за широката общественост за намаляване на вредата от консумацията на алкохол. В бъдеще активните компоненти в лимоновия сок трябва да се отделят и идентифицират и да се проучи механизмът на действие на пречистеното съединение, включително действието върху тънките черва.

5. Заключения

Хроничната консумация на алкохол може да предизвика увреждане на черния дроб. Лимоновият сок е лесно достъпен като широко консумирана напитка. В това проучване установихме, че лечението с лимонов сок упражнява хепатопротективни ефекти върху причиненото от алкохол увреждане на черния дроб при мишки чрез намаляване на нивата на серумни ALT и AST, както и чернодробна TG и липидна пероксидация. В допълнение, експериментът с лимонов ин витро антиоксидант показа, че лимонът има средни ин витро антиоксидантни способности. Затова предполагаме, че хепатопротективните ефекти могат да бъдат свързани с антиоксидантните способности на лимоновия сок. Резултатите показаха, че лимоновият сок може да бъде потенциална хранителна добавка за профилактика и лечение на чернодробни увреждания, свързани с хронична консумация на алкохол.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Националната фондация за естествени науки на Китай (№ 81372976), Ключов проект на Програма за наука и технологии в провинция Гуангдонг (№ 2014B020205002) и Схемата за сто таланти на университета Сун Ятсен.