Катедра по фармакологични и фармацевтични науки, Фармацевтичен колеж, Университет в Хюстън, Хюстън, Тексас

Катедра по фармакологични и фармацевтични науки, Фармацевтичен колеж, Университет в Хюстън, Хюстън, Тексас

Катедра по фармакологични и фармацевтични науки, Фармацевтичен колеж, Университет в Хюстън, Хюстън, Тексас

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: T. Hussain, Univ. от Хюстън, Хюстън, Тексас 77204-5037 (имейл: [имейл защитен]).

Резюме

приемът на високо натрий е рисков фактор за патогенезата на хипертонията, особено при затлъстяване (40, 44). Има многобройни проучвания както при модели със затлъстяване при хора, така и при животни, които предполагат, че вътребъбречните механизми като хиперактивация на ренин-ангиотензиновата система (RAS), повишен симпатиков тонус и физическа компресия на бъбреците причиняват прекомерна тубулна реабсорбция на натрий, водеща до разширяване на обема и увеличаване на кръвта налягане (21–23, 29, 36, 38, 41). Наскоро съобщихме, че диетата с високо съдържание на натрий (HSD) причинява повишаване на кръвното налягане (44) на плъхове със затлъстяване Zucker, модел на гризачи, широко използван за разбиране на свързаната със затлъстяването бъбречна дисфункция и хипертония (5, 7, 9). Освен това повишаването на кръвното налягане е свързано с повишаване на антинатриуретичния пептид ANG II и намаляване на пронатриуретичния пептид ANG (1–7) в бъбречната кора на тези животни (44).

Експериментален протокол

Мъжки затлъстели плъхове Zucker (10-11 седмици) са закупени от Harlan (Indianapolis, IN). След пристигането си животните бяха настанени в заведението за грижа за животните в университета в Хюстън. Експерименталните протоколи за животни, използвани в това проучване, бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните в университета в Хюстън. Мъжки затлъстели плъхове са лекувани с AT2R агонист C21 (1 mg · kg -1 ден дневно -1, перорално), като същевременно се поддържат или на нормална натриева диета (NSD; 0,4%) или HSD (4%) в продължение на 2 седмици. Плъховете бяха поставени в метаболитни клетки за крайни 4 дни. Регистрирани са двадесет и четири часа прием на храна и вода и ежедневно се събира урина през последния 3-дневен период. Телесното тегло за всеки плъх се записва преди започване на лечението и по време на прекратяване на експеримента.

Скорост на гломерулна филтрация чрез FITC-метод за очистване на инулина

На ден 7 от лечението с С21, микроосмотични помпи (Alzet, модел 1002), пълни с FITC-инулин (5% във физиологичен разтвор), бяха поставени в перитонеалната кухина на плъховете под анестезия с изофлуран. На дни 13 и 14., бяха събрани проби от кръв (80 μl) от опашната вена. Броят на флуоресцентните количества на FITC-инулин в плазмени проби и в урина, събрани в същите дни (описани по-горе), се определя с помощта на спектрофлуорометър (Cytofluor Series 4000, Applied Biosystem). Скоростта на гломерулна филтрация (GFR) се изчислява, като се използва формулата GFR = (броя на флуоресценцията на урината/24 часа)/(броят на плазмената флуоресценция/μl) и се отчита като μl/min (5, 39).

Кръвно налягане и сърдечен ритъм чрез телеметрия

Плъховете с наднормено тегло се гладуват през нощта и се лекуват хирургично с упойка Маркаин. След разрез по средната линия, телеметричната сонда (модел PA C-40, Data Sciences International, St. Paul, MN) беше имплантирана в коремната аорта под изофлуранова анестезия (5% индукция, 3-4% поддръжка при 1,5 l/min). След имплантацията мускулната коремна стена беше затворена с 4-0 полиестерен шев, който също закрепи телеметричната сонда към предната коремна стена. Кожата се затваря с щипки за рани и се инжектира карпрофен (5 mg/kg телесно тегло ip) на всеки 24 часа в продължение на 3 дни след операцията. Животните бяха оставени да се възстановят от операцията по имплантиране в продължение на 7 дни преди започване на лечението с AT2R агонист С21. Животните бяха настанени поотделно, като всяка клетка беше поставена над приемник, използван за наблюдение на телеметричния сигнал за кръвното налягане и сърдечната честота. Софтуерът за събиране на данни (Data Quest ART, Data Sciences) е конфигуриран да взема проби от 15-секундно отчитане на кръвното налягане на всеки 15 минути в хода на проучването. Двадесет и четиричасовите показания бяха усреднени, за да осигурят ежедневното отчитане на кръвното налягане. В края на измерванията на кръвното налягане и изследването на метаболитната клетка животните бяха евтаназирани и бъбреците бяха отстранени, изсушени, изтеглени и съхранявани замразени при -80 ° C за биохимични анализи.

Обем на урината и натрий

Урината, събрана на всеки 24-часов период в продължение на 3 последователни дни, е осреднена за всяко животно и е представена като 24-часов обем урина, ml/ден. Натрият във всяка проба от урина се определя от атомно-абсорбционния спектрометър Perkin Elmer AAnalyst 400. Подобно на обема на урината, стойностите на обема Na в урината (UNaV) във всяка проба от урина, събрана в продължение на 3 дни за всяко животно, бяха осреднени и представени като μmol/ден.

Нитрати в урината

Нитратите в урината се измерват с реактив на Griess. Накратко, 2 ml фракция от 24-часова урина се филтрира с помощта на центробежни филтри Amicon Ultracel-10K за 1 h и филтратът се разрежда 10 пъти. За определяне на нитрати, 50 μl филтрирана урина са оставени да реагират с 10 μl нитрат редуктаза ензимен препарат и 10 μl препарат кофактор с леко разклащане в продължение на 15 минути. След тези проби, нитратните стандарти (0–100 μM) и заготовките (дестилирана вода) се оставят да реагират с 50 μl 2% сулфаниламид в 5% фосфорна киселина в продължение на 20 минути на тъмно с леко разклащане и след това с 50 μl 0,2% NEDD за 20 минути на тъмно с леко разклащане. Образуваното азо багрило се измерва при 540 nm и нитратите в урината се отчитат като μmol/ден.

RAS компоненти

Уестърн блотинг.

Експресията на AT1R, AT2R, ACE и химаза в бъбречната кора се определя чрез Western blotting. За тази цел бъбречните кори се хомогенизират в буфера, съдържащ (в тМ) 50 Tris, 10 EDTA, 1 PMSF и протеазни инхибитори. Равни количества протеин (30 μg за AT1R, 60 μg за AT2R, 40 μg за ACE, 40 μg за химаза) от различни групи плъхове се подлагат на SDS-PAGE и Western blotting, като се използват съответните първични антитела за AT1R, AT2R, ACE, и химаза. След инкубацията с първичните антитела, петна се инкубират със съответните конюгирани IgG от хрян пероксидаза. Сигналът се открива чрез ECL система, записва се и се анализира за денситометрия на лентите от Fluorchem 8800 (Alpha Innotech Imaging System, San Leandro, CA). Петната бяха отстранени и повторно изследвани с β-актинови миши моноклонални антитела.

Активност на ренин и ACE2.

Активността на ренин и ангиотензин-конвертиращ ензим тип 2 (ACE2) в кората на бъбреците са измерени съответно чрез Sensolyte 520 и Sensolyte 390 kit (Anaspec, Fremont, CA). Тези комплекти осигуряват Mca/Dnp флуоресцентен резонансен енергиен пренос на енергия (FRET) пептид като матричен металопротеинази (MMPs) субстрат. В непокътнатия FRET пептид флуоресценцията на Mca се потушава от Dnp. При разцепване на два отделни фрагмента от MMPs, флуоресценцията на Mca се възстановява и може да се наблюдава при дължини на вълната на възбуждане/излъчване (490 nm/520 nm за ренин и 330 nm/390 nm за ACE2).

Ангиотензинови пептиди.

Нивата на ANG II и ANG (1–7) пептиди в бъбречната кора са количествено определени с помощта на LC/MS, както описахме наскоро (6). Тъканта се хомогенизира в лизисен буфер (10 mM Tris, рН 7.4), центрофугира се в продължение на 15 минути при 1600 ж, разтвор, съдържащ супернатант, се зарежда върху патрон С18-Е (55 μm, 70А) и се уравновесява с 60% ацетонитрил, 1% трифлуороцетна киселина и 39% дестилирана вода. Колоната се елуира с равновесния буфер и се събира в епруветка от 15 ml. Елуентът беше изсушен и разтворен в 80% ацетонитрил и 0,1% мравчена киселина преди LC/MS анализ на пептидите.

Химикали

C21 е синтезиран по поръчка (SPS Alfachem). Антитела за ACE (sc-12187) и β-актин (sc-47778) са закупени от Санта Круз. Химазно антитяло (MA5-11717) е закупено от Thermo Scientific (Rockford, IL). AT2R антитяло (EZBiolab, Westfielld, IL) и AT1R антитяло (Biomolecular Integrations, Little Rock, AR) бяха отгледани по поръчка в заек. Всички други използвани химикали са със стандартен клас и са закупени от Sigma (Сейнт Луис, Мисури). Нитратно-редуктазният ензим (780010) и кофакторният препарат (780012) са закупени от Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± SE. Данните бяха анализирани с помощта на GraphPad Prism 4 (GraphPad, Сан Диего, Калифорния) и подложени на еднопосочен ANOVA с Newman-Keuls post hoc тест с н = 5 във всяка група, както е описано подробно в легендите на фигурата. A P стойност на

Таблица 1. Общи и бъбречни параметри на контролни и лекувани със С21 плъхове със затлъстяване, хранени с NSD или HSD

Стойностите са средни стойности ± SE; Еднопосочен ANOVA, последван от тест на Нюман-Кийлс, P * Стойностите са средно 24 часа нататък ден 14.

† Значително различен от контролния затлъстял.

‡ Значително различен от плъхове, хранени с HSD.

Плъховете, хранени с HSD и/или третирани със С21, са имали сходно телесно тегло (Таблица 1); въпреки че се наблюдава значително по-високо повишаване на телесното тегло при плъхове, хранени с HSD (HSD 74 ± 5 ​​срещу NSD 45 ± 8 g спрямо съответното основно тегло) за 2-седмичен период на лечение. Лечението със С21 предотвратява увеличаването на наддаването на телесно тегло на плъхове, хранени с HSD. Теглото на бъбреците е непроменено сред изследваните групи (Таблица 1).

GFR е намален значително при хранене с HSD в сравнение с контролите, хранени с NSD (NSD 654 ± 82 срещу HSD 202 ± 81 μl/min). Лечението с C21 спаси GFR при животни, хранени с HSD (HSD + C21 482 ± 47 μl/min), но няма ефект при плъхове, хранени с NSD (Таблица 1).

Обем на урината и екскреция на натрий

В сравнение с контролите с NSD, хранените с HSD плъхове отделят по-голямо количество урина (HSD 19 ± 2 срещу NSD 9 ± 1 ml/ден) и натрий в урината (HSD 8 ± 0,6 срещу NSD 3 ± 0,4 μmol/ден). Лечението със С21 причинява значително увеличение както на обема на урината, така и на екскрецията на натрий при плъхове, хранени с NSD или HSD (Таблица 1 и Фиг. 1).

предотвратява

Фиг. 1.Схематично представяне на протокола, използван в изследването.

Екскреция на нитрати в урината

Установено е, че екскрецията на нитрати с урина (HSD 1.45 ± 0.22 спрямо CT 0.69 ± 0.07 μmol/ден) е значително увеличена при животни, хранени с HSD, в сравнение с тази на контролните животни. Лечението със С21 причинява допълнително увеличаване на нитратите в урината при плъхове, хранени с HSD (Таблица 1).

Систолично кръвно налягане

Както е показано на фиг. 2, телеметричното наблюдение разкрива, че приемът на HSD е причинил значително повишаване на систолното кръвно налягане в продължение на 2 седмици от диетичния режим. Въпреки че повишаването на кръвното налягане беше постепенно по време на хранене с HSD, нарастването през втората седмица на хранене с HSD изглежда беше плато, като беше максимално увеличение от 27 mmHg. Лечението със С21 напълно предотвратява повишеното на HSD повишаване на кръвното налягане. Кръвното налягане при плъхове, хранени с NSD, не се повлиява от лечението със С21. Сърдечната честота и диастоличното кръвно налягане остават сходни във всички групи през периода на лечение (само таблица 1 ден 14 данните са представени).

Фиг. 2.Систолично кръвно налягане при контролни и лекувани със С21 плъхове със затлъстяване, хранени с нормална или високонатриева диета (HSD) за 2 седмици. @ Значително различен в сравнение с контролните плъхове. # Значително различен от HSD затлъстели плъхове. Стойностите са средни стойности ± SE; Еднопосочен ANOVA, последван от тест на Нюман-Кийлс, P

RAS компоненти

AT1R и AT2R.

Храненето с HSD или лечението с C21 на плъхове, хранени с NSD, няма ефект върху експресията на кората AT1R (43-kDa лента). Въпреки това, експресията на AT1R при плъхове, хранени с HSD, в сравнение с която и да е от групите беше намалена наполовина чрез третиране със С21 (Фиг. 3A). Western blot показва наличие на AT2R като три ленти (44/45 и 39 kDa) в бъбречната кора. Тези три ленти на AT2R се дължат на различни степени на гликозилиране, както демонстрирахме по-рано (19). Композитната денситометрия на всичките три ленти на AT2R разкрива, че кортикалната експресия на AT2R не е засегната нито от HSD хранене и/или лечение с C21 (Фиг. 3Б.).

Фиг. 3.Експресия на ангиотензин тип 1 рецептор (AT1R; A) и AT2R (Б.) в бъбречната кора на контролни и лекувани със С21 плъхове със затлъстяване, хранени с диета с нормален натрий или HSD. Горна част панели: представителни Western blots за съответните протеини с контрол на натоварването β-актин. Стълбовидни графики: представляват съотношението на плътността на съответните протеинови ленти и β-актин, т.е. AT1/β-актин, AT2/β-актин. # Значително различни в сравнение с плъхове, лекувани със затлъстяване с HSD. Стойностите са средни стойности ± SE; Еднопосочен ANOVA, последван от тест на Нюман-Кийлс, P

Ренинова активност и експресия на химаза.

Активността на кортикалния ренин във всички лекувани групи остава незасегната (Фиг. 4A). Western blot на бъбречната кора разкрива 35-kDa лента за химаза, която също остава незасегната от HSD и/или C21 лечения (Фиг. 4Б.).

Фиг. 4.Ренинова активност (A), химазна експресия (Б.), експресия на ангиотензин-конвертиращ ензим (ACE) (° С), Активност ACE2 (д) и ANG II (Е.) и ANG (1–7) (F) нива на пептиди в кората на бъбреците на контролни и лекувани със С21 плъхове със затлъстяване, хранени с диета с нормален натрий или HSD. Горна част панели: представителни Western блотове за съответните протеини с контрол на натоварването β-актин. Стълбовидни графики: представляват съотношението на плътността на съответните протеинови ленти и β-актин, т.е. ACE/β-актин, химаза/β-актин. @ Значително различен в сравнение с контролните плъхове. # Значително различен от HSD затлъстели плъхове. Стойностите са средни стойности ± SE; Еднопосочен ANOVA, последван от тест на Нюман-Кийлс, P

ACE експресия и ACE2 активност.

Western blot на кората на бъбреците открива 170-kDa лента за ACE (фиг. 4° С). Денситометрията на тези ленти предполага, че експресията на АСЕ не е била засегната от хранене с HSD и/или лечение с C21. Напротив, активността на ACE2 в бъбречната кора е значително намалена след хранене с HSD и това намаляване е предотвратено чрез лечение с C21 (Фиг. 4д).

Ангиотензинови пептиди.

Нивата на ANG II в бъбречната кора на плъхове, хранени с HSD, са почти четири пъти по-високи от контролите с NSD. Лечението с C21 отслабва нарастването на ANG II, предизвикано от HSD, при затлъстели плъхове (фиг. 4Е.). Противно на промените в ANG II, нивото на ANG (1–7) е намалено чрез хранене с HSD и това намаление е спасено до нормално ниво чрез лечение с C21 (фиг. 4F).

Подобрената реабсорбция на Na бъбреците е основен фактор за патогенезата на хипертонията със затлъстяване. Точният механизъм обаче е неясен, но преувеличената бъбречна реабсорбция на Na, свързана с разширяване на обема, водеща до повишено периферно съпротивление, се счита за цялостен механизъм (22). В настоящото проучване индуцираният от AT2R агонист С21 диуреза/натриуреза и евентуално намаляване на интраваскуларния обем, както е показано чрез намалено наддаване на тегло, може да представлява глобален механизъм, отговорен за понижаване на кръвното налягане при плъхове, хранени с HSD Също така забелязахме, че плъхове със затлъстяване, хранени с HSD, показват намален GFR, индикация за хронично бъбречно заболяване (50), което може да бъде следствие от продължителна хипертония. Затлъстелите плъхове започват да проявяват гломерулосклероза в по-ранна възраст (12); вероятно е в допълнение към по-високото кръвно налягане, приемът на високо натрий сам по себе си да е ускорил гломерулна травма при плъхове, хранени с HSD. Активирането на AT2R изглежда защитно, както предложихме по-рано (12). Тъй като намалената GFR е свързана с повишено задържане на натрий в бъбреците, вероятно е повишаването на GFR при плъхове, хранени с HSD, в отговор на лечението с C21 да доведе до възстановяване на екскрецията на натрий в урината и по този начин защита срещу повишаване на кръвното налягане при тези животни.

Кръвното налягане на плъхове със затлъстяване, хранени с NSD, не е повлияно от лечението със С21, което противоречи на нашия предходен доклад (5). Разминаването обаче може да се основава на 1) агонист: в по-ранно проучване, CGP42112A, пептиден агонист, е доставен чрез осмотична помпа, имплантирана подкожно; в настоящото проучване C21, нов перорално активен непептиден агонист, е даван орално на животните и 2) методи, използвани за измерване на кръвното налягане: в по-ранните проучвания кръвното налягане се измерва само при стрес (анестезия или маншет на опашката) (5, 42), което води до повишаване на кръвното налягане (28), което се предотвратява при третирани с CGP42112A животни ( 5). Настоящото проучване използва радиотелеметричен подход за непрекъснато измерване на кръвното налягане в продължение на 2 седмици при свободно движещи се животни. Някои проучвания (33), включително нашите непубликувани данни (средно артериално налягане: затлъстяване 107 ± 1, постно 103 ± 1 mmHg), предполагат, че затлъстелите плъхове в тази възрастова група може да не са хипертоници, поради което не се очаква C21 да понижава кръвното налягане в контролирайте затлъстелите плъхове.

В обобщение, настоящото проучване показва, че активирането на AT2R с нов агонист С21 предотвратява индуцирано от солта повишаване на кръвното налягане при плъхове със затлъстяване Zucker. По-нататъшното лечение с C21 причинява намаляване на експресията на антинатриуретичните нива на ANG II/AT1R и нивата на пронатриуретичен ANG (1–7), което предполага тяхното потенциално участие в антихипертензивните ефекти на активирането на AT2R при затлъстяване с прием на високо натрий.

Това проучване е подкрепено от Националния здравен институт R01 Grant DK61578 .

Не се декларират конфликти на интереси, финансови или други, от автора (авторите).