Субекти

Резюме

Въведение

Паразитните червеи в стомашно-чревния тракт (хелминти) са патогени от глобално значение. Хелминти са основна производствена пречка в животновъдството по целия свят; инфекциите водят до по-ниски темпове на растеж и намалено производство на мляко и месо от преживни животни и свине 1,2,3, както и до обостряне на вторични бактериални инфекции 4, което води до намалена продоволствена сигурност и икономическо развитие. Освен това се изчислява, че повече от милиард души, главно в развиващите се страни, са заразени с почвени хелминти, причинявайки значителна заболеваемост .

Понастоящем няма налични ваксини, контролът върху хелминти се основава почти изключително на масово лечение със синтетични противоглистни лекарства. Това прекомерно разчитане на ограничен брой химични съединения в крайна сметка не е устойчиво 6. Устойчивостта на противоглистни средства е широко разпространена в животновъдните системи, особено при дребните преживни животни, където е достигнала критични нива 7, но е установена и сред паразити от говеда 8 и свине 9 и има постоянни опасения относно устойчивостта на масовото прилагане на лекарства при хората 10. Освен това има нарастващо потребителско търсене на животински продукти, които се произвеждат по биологичен начин или с минимални вложени синтетични химикали 11. Следователно има спешна нужда да се проучат нови подходи за контрол на хелминти.

Много растения са богат източник на биоактивни съединения, които могат да имат антимикробни и антипаразитни ефекти, включително етерични масла и вторични метаболити. Появата на антипаразитни съединения в растенията позволява възможността за целенасочена идентификация на съединението за откриване на лекарства, както и използването на растения като хранителни вещества. По този начин в диетата се включват или цели растителни материали, или екстракти, представляващи алтернативен или допълващ подход за борба с паразитите, особено при животни 12. Този подход има много предимства, като избягване на остатъци от лекарства в селскостопанските продукти, по-нисък риск от паразити да развият устойчивост и лесна интеграция в ограничени от ресурси общности в развиващия се свят, ако и където растенията са на разположение на местно ниво .

антихелминтна

Примери за А-тип и В-тип процианидинов димер.

Резултати

Екстрактът от кора на канела има мощна активност срещу Ascaris suum in vitro

За да проверим дали канелената кора съдържа съединения с антихелминтна активност, ние приготвихме екстракт, използвайки процедура, която преди това доказахме, че е ефективна при извличането на полифенолни съединения от голямо разнообразие от растителни източници След това полученият екстракт беше тестван за инвитро активност срещу ларви на Ascaris suum, важен нематоден паразит по свинете, който също служи като модел за близкородствения човешки паразит A. lumbricoides 23. .

За първи път използвахме анализ за инхибиране на миграцията, за да тестваме активността срещу ларви от трети етап (L3), етапа на паразита, който излиза от ембрионирали яйца, за да зарази гостоприемника 22. Поразително е, че инкубацията на L3 през нощта в екстракта от канела при концентрации между 125 и 1000 μg/mL води до 100% инхибиране на миграцията на ларвите (Фиг. 2А). За разлика от това, по-рано забелязахме, че екстрактите, приготвени от редица други биоактивни растителни източници, предизвикват по-малко мощно, дозозависимо инхибиране на миграцията в тествания диапазон на концентрациите на екстракти 22. Последващото наблюдение на ларвите по време на инкубацията в екстракта от канела разкрива, че при концентрации ≥250 μg/ml всички ларви загиват в рамките на два-три часа след инкубацията. Потвърдихме ефикасността на екстракта от канела във втори експеримент, използвайки ларви от четвърти етап (L4) на A. suum възстановени от червата на свинете след експериментална инфекция и отново наблюдаващи смъртността на ларвите в рамките на часове след инвитро инкубация (фиг. 2Б).

Антихелминтни ефекти на екстракта от канелена кора срещу Ascaris suum.

(а) Инхибиране на A. suum миграция на ларви от трети етап след инкубация в екстракт от кора на канела. Инхибирането се изразява по отношение на ларвите, инкубирани само в културална среда. Резултатите са средствата на три независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра. (б) Инхибиране на A. suum подвижност на ларвите от четвърти етап след инкубация в екстракта от канелена кора. Резултатите са от един експеримент, извършен в три екземпляра.

Фитохимичен анализ на екстракт от кора на канела

За да идентифицираме предполагаемите антихелминтни съединения, анализирахме екстракта чрез LC-MS. Основното съединение е CA, което представлява 7,8 g/100 g от екстракта (фиг. 3А). В допълнение, канелената киселина и няколко PAC димери и тримери с връзки от тип А бяха открити от LC-MS (фиг. 3А). За да се получи по-нататъшна представа за състава на РАС, екстрактът беше подложен на тиолиза с бензил меркаптан, който разгражда РАС полимерите с връзки от тип В и позволява количествено определяне на съставните им единици флаван-3-ол 24,25. Това разкри, че тези PAC канела са процианидини, които се състоят от катехин и епикатехин като крайни и удължаващи звена (фиг. 3В; Таблица 1). Изчислените пропорции на под-единици флаван-3-ол са показани в таблици S1-2. От тази информация може да се изчисли както общото количество PAC, така и средната степен на полимеризация (mDP - т.е. средната дължина на полимерите). Това разкри, че екстрактът съдържа 24,2 g PAC/100 g екстракт и mDP е 5,2. Освен това, анализът на междуфлаваноловите връзки показа, че 21% са връзки от тип А и 79% от връзки от тип В (таблица 1).

HPLC хроматограми на екстракт от кора на канела.

(а) HPLC хроматограма на екстракт от кора на канела: Горният панел показва откриване на транс-цинамалдехид. Долният панел показва по-голяма версия на областта, обозначена с червената стрелка в горния панел, показва 2, A-тип процианидин (PC) димер; 3, A-тип PC тример; 5, A-тип PC тример; 6, вътрешен стандарт; 7, цис—Канелена киселина; 9, транс—Канелена киселина. (б) HPLC хроматограма на екстракт от тиолизирана кора от канела (BM = адукт на бензилмеркаптан): 1, Катехин; 2, A-тип PC димер; 3, A-тип PC тример; 4, Епикатехин; 5, A-тип PC тример; 6, Вътрешен стандарт; 7, цис—Канелена киселина; 8, A-type PC — BM тример; 9, транс—Канелена киселина; 10, цис Катехин — BM; 11., Епикатехин — BM; 12, A-type PC — BM димер.

За да се определи дали PAC е отговорен главно за мощната активност на екстракта от канела, две обогатени с PAC фракции са изолирани от екстракта с помощта на Sephadex LH-20 хроматография, която отделя екстракта въз основа на размера, за да се получат две обогатени с PAC фракции (F1 и F2). Първата фракция (F1) съдържа 52,4 g PAC/100 g фракция и това са PAC с по-ниско молекулно тегло (определено чрез тиолиза; mDP от 3,7), докато F2 съдържа 55,0 g PAC/100 g фракция, състояща се от PAC с по-високо молекулно тегло (mDP от 7; Таблица 1). F1 фракцията съдържа само следи от CA, докато CA не се открива във F2 фракцията (данните не са показани).

Активност на проантоцианидини, получени от кора на канела срещу Ascaris suum

Антихелминтни ефекти на изолирани фракции на проантоцианидин (PAC).

(а) Инхибиране на Ascaris suum миграция на ларви от трети етап (L3) след инкубация в PAC фракции F1 и F2. Инхибирането се изразява по отношение на ларвите, инкубирани само в културална среда. Резултатите са средствата на два независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра. Лентите за грешки показват интерпретираното SEM. (б) Инхибиране на A. suum подвижност на ларви от четвърти етап (L4) след инкубация в PAC фракция F2. Резултатите са от един експеримент, извършен в три екземпляра. Лентите за грешки показват интерпретираното SEM. (° С) Инкубацията в PVPP не премахва антихелминтните ефекти на екстракта от канелена кора. Резултатите са средствата на два независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра.

Антихелминтна активност на транс-цинамалдехид инвитро

Антихелминтни ефекти на чистия транс-цинамалдехид (CA).

(а) Антихелминтни ефекти на CA срещу Ascaris suum ларви от трети етап (L3) и четвърти етап (L4). Смъртност на A. suum се оценява след 12 часа инкубация за L3 и 6 часа за L4. Резултатите от L3 са средните стойности на три независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра, а резултатите от L4 са от един експеримент, извършен в три екземпляра. Лентите за грешки показват интерпретираното SEM. (б) Антихелминтни ефекти на CA срещу Oesophagostomum dentatum L3 и Trichuris suis ларви от първи етап (L1). Смъртност на O. dentatum се измерва чрез анализ на инхибиране на миграцията на базата на агар след инкубация през нощта в CA и T. suis смъртност чрез наблюдение на подвижността след 2 часа инкубация. O. dentatum резултатите са средните стойности на два независими експеримента, всеки от които се извършва в три екземпляра и T. suis резултати от единичен експеримент, извършен в три екземпляра. Лентите за грешки показват интерпретираното SEM.

Ултраструктурни повреди в Ascaris suum изложени на транс-цинамалдехид

За да получите представа за възможните противоглистни механизми на CA, A. suum L4, които са били изложени на висока концентрация на СА (236 μM), се изследват чрез пропускаща електронна микроскопия. Изследването на кутикулата и хиподермата не разкрива значителни промени в изложените на СА ларви, но се наблюдават някои локализирани тъканни увреждания и лезии в мускулния слой под хиподермата (фиг. 6А). Най-поразителното увреждане на изложените на СА ларви е настъпило в храносмилателните тъкани (фиг. 6В). Докато контролните ларви са имали правилна, непокътната черва с неповредени микровили, същите тъкани са били напълно унищожени в ларви, изложени на CA, като микроворците са загубили цялата си цялост и с масивни лезии и вакуоли. По този начин изглежда, че увреждането на вътрешните храносмилателни тъкани може да бъде поне частично отговорно за антихелминтната активност на CA.

Ултраструктурни промени в Ascaris suum изложени на транс-цинамалдехид.

Предавателни електронни микрографии на A. suum ларви от четвърти етап, изложени на културална среда (Control) или 236 μM транс-цинамалдехид (СА) за 12 часа. За всички панели скалата показва 2 μm. (а) Кутикула (cu) и подлежаща мускулна (mu) тъкан - обърнете внимание на лезиите в мускулната тъкан, подлежащи на кутикулата и хиподермата при паразити, изложени на CA (червени стрелки). (б) Храносмилателни тъкани, показващи микровилите (mv), покриващи лумена на червата - забележете унищожаването на въсичките (червен кръг) и наличието на големи вакуоли (червена стрелка) при паразити, изложени на CA.

Тестване на транс-цинамалдехид срещу Ascaris suum in vivo

80%) са открити през третото тримесечие на SI при всички свине. Прасетата, дозирани с CA капсули, са имали повече ларви, разположени в четвъртото (най-задното) тримесечие (20%) в сравнение с контролата (10%) или тези, хранени с CA в диетата (15%), но тези разлики също не са били значителни (Фиг. 7В; P = 0,3 по еднопосочен ANOVA). Следователно, въпреки своята мощност инвитро дейност, CA не успя да има in vivo ефект в този модел на A. suum инфекция.

Обща сума Ascaris suum тежести на ларвите и разпределение на ларвите в червата на приложените прасета транс-цинамалдехид.

(а) Брой ларви от четвърти етап (L4) в тънките черва (SI) на 14-ия ден след инфекцията (p.i.) при свине, хранени или транс-цинамалдехид (CA) в диетата ежедневно (‘CA диета’), дозиран с капсулиран CA в дни 11 и 13 p.i. („CA капсули“) или неприложен CA („Control“). Посочена е средната стойност и SEM. (б) Пропорции на L4, възстановени от трите групи в сегмент 1 (проксимална половина на SI), сегмент 2 (трета четвърт на SI) и сегмент 3 (дистална четвърт на SI). Вижте материали и методи за допълнителна информация.

Дискусия

Докато бързата абсорбция на CA от стомаха намалява потенциала му като антихелминтно средство срещу чревни паразити, формулирането на съединението за повишаване на неговата стабилност може да представлява вариант за преодоляване на този проблем. По-специално, Si и др. са показали, че емулгирането на етерични масла (включително СА) в различни хидроколоиди може да се възстанови инвитро антимикробна активност, която се губи в присъствието на диетични съединения на свине 41. Следователно, експерименти за определяне дали емулгиращите/стабилизиращите агенти могат да подобрят in vivo антихелминтната активност на CA е оправдана, както и проучванията срещу паразити, пребиваващи в предните области на тънките черва. Нещо повече, оптимизирането на процедурите за микрокапсулиране за защита на съединението и улесняване на бавното му освобождаване в червата също може да бъде подходящ вариант.

В заключение показахме за първи път, че канелената кора има противоглистен потенциал инвитро и това произтича както от неговите проантоцианидинови танини, така и най-вече от транс-цинамалдехид. Въпреки това, за потенциала на транс-цинамалдехид да се реализира като антихелминт срещу чревни хелминти in vivo, подходящи формулировки за стабилизиране и защита на съединението вероятно ще са необходими.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички експерименти с животни са одобрени от звеното за експериментални животни към Университета в Копенхаген и са проведени в съответствие с насоките на Датската инспекция за експерименти с животни (номер на лиценз 2010/561-1914).

Експериментален дизайн

Схематично очертание на експерименталния дизайн за антихелминтно изпитване е представено на фиг. 8. Екстрактът от кора на канела първо е извлечен и тестван срещу A. suum in vitro използвайки анализи за инхибиране на миграцията и подвижността. От екстракта бяха получени две PAC фракции, които също бяха тествани A. suum in vitro. След това Pure CA е закупен в търговската мрежа и е тестван A. suum, O. dentatum и T. suis ларви инвитро и A. suum ларви in vivo.