1 Евразийски национален университет, Астана, Казахстан

проучване

2 Институтът по ядрена физика на Република Казахстан, Астана, Казахстан

3 Инженерно училище, Университет Назарбаев, Астана, Казахстан

4 Уралски федерален университет, кръстен на първия президент на Русия Б. Н. Елцин, Екатеринбург, Русия

5 Национален изследователски ядрен университет “MEPhI”, Москва, Русия

6 Институт по химия на нови материали, Национална академия на науките на Беларус, 36 Fr. Улица Скарина, 220141 Минск, Беларус

7 Център за научни и практически материали, Национална академия на науките на Беларус, 220072 Минск, Беларус

Резюме

Поради анизотропията на формата на нанотръбите Ni, ниската специфична плътност, голямата специфична повърхност и равномерното магнитно поле, те са предложени като носители за целенасочена доставка на лекарство или протеин и процеса на тяхното формиране от стадия на синтез до етапа на повърхностна модификация и бе демонстрирано свързване с протеини. Приложени са някои стъпки за ускоряване на тяхното биомедицинско приложение. Първо, за да има пълен контрол върху размерите на носителя и параметрите на структурата, е приложен метод на електроосаждане в порите на полиетилен терефталат. Второ, за да се разбере обхватът на приложението на наноструктури Ni, е изследвано тяхното разграждане в среда с различна киселинност. Трето, за да се подобри биосъвместимостта и да се направи възможно закрепването на полезния товар, е извършена модификация на повърхността на нанотръбите с кремнийорганично съединение. Най-накрая е разработена схемата на прикрепване на протеини към наноструктурната повърхност и процесът на свързване е демонстриран като пример за говежди серумен албумин.

1. Предистория

В повечето случаи сферичните магнитни наночастици се разглеждат като носители на лекарства и протеини [9, 10]. Малкият магнитен момент на тези частици обаче затруднява фокусирането на магнитното поле върху тях. Този проблем не позволява да се направи достатъчна сила за съпротивлението на кръвния поток. Наножиците и нанотръбите (NT) позволяват да се преодолеят типичните ограничения за наночастиците поради тяхната удължена форма и анизотропия на магнитните свойства [11–19]. В сравнение с наножиците, NT имат някои потенциални предимства. Липсата на магнитно ядро ​​прави възможно създаването на наноструктури с еднородно магнитно поле [15]. По-ниската плътност им позволява да плават в течности (включително биологичните). Голямата специфична повърхност на NT осигурява по-функционални групи за прикачване на повече товари за целева доставка.

Като се има предвид простотата на моделирането на физическите свойства и предсказуемостта на поведението в биологични среди, се предпочитат носители, проектирани на базата на чисти магнитни материали (Fe, Co и Ni), всеки от които има своите предимства и недостатъци. Fe NSs често се считат за най-привлекателните, но могат лесно да се окислят в човешки течности. Pure Co е по-резистивен, но има огромна принудителна сила, която води до конгломерация на NSs по време на използването им в магнитно поле. Ni NSs също са устойчиви на окисляване и имат ниска принудителна сила, което ги прави най-привлекателни за създаването на носител. Трябва да се отбележи, че някои никелови оксиди са токсични и вредни за органичните клетки [20]. Проблемът с окисляването на NSs може да бъде решен чрез създаване на инертна обвивка (защитен слой) върху тяхната повърхност. Има някои изисквания към защитния слой като липса на биоактивност, устойчивост на биоразграждане и стабилност и той трябва да има специални функционални групи, които да правят връзки с полезния товар. Тези изисквания отговарят на органични (полимери) [21], неорганични (силан) [22] и златни покрития [23].

Като се има предвид, че NT, базирани на феромагнитни метали като носители за целенасочена доставка, не са били проучвани по-рано, в нашата работа беше проведено цялостно разследване, от процеса на синтез до свързващия полезен товар. Предложеният метод за електроосаждане на NTs в PET шаблон е прост и мащабируем и позволява контролиране на формираните параметри на NSs (дължина, диаметър и дебелина на стената) [24]. Ni е избран за NSs материал, тъй като е естествен материал и основно хранително вещество [25]. Като се вземе предвид токсичността на никеловите оксиди [20], разграждането на Ni NTs е изследвано в зависимост от средната киселинност на средата при различно време на експозиция и е разгледана възможността за повърхностна модификация с кремнийорганично съединение. Освен това беше показана схемата на прикрепване на протеини към повърхността на NSs и демонстрирано свързване на говежди серумен албумин като пример за полезен товар.

2. Методи

Трафирани мембрани на основата на полиетилен терефталат (PET) са използвани като шаблони с дебелина 12 микрона, номинален диаметър на порите 400 nm и плътност на

cm −2. Електрохимичното отлагане се извършва при напрежение 1,75 V, като се използва електролит: NiSO4 × 6H2O (100 g/l), H3BO3 (45 g/l) и аскорбинова киселина (1,5 g/l) при температура 25 ° C; рН на електролита е равно на 3.

Характеризирането на структурните характеристики се извършва чрез метод на сканираща електронна микроскопия (SEM, Hitachi TM3030), рентгенова спектроскопия с енергийна дисперсия (EDS, Bruker XFlash MIN SVE) и рентгенов дифракционен анализ (XRD, Bruker D8 ADVANCE) с използване на Cu

радиация и избрана област електронна дифракция (SAED, JEOL JEM-100). Контролът на вътрешните диаметри и оценката на дебелината на стените беше извършен чрез методи за газопропускливост (Sartocheck® 3 Plus 16290) и трансмисионна електронна микроскопия (TEM, JEOL JEM-100). Магнитните характеристики на Ni NT са изследвани на универсална измервателна система (автоматичен вибрационен магнитометър) „Система за измерване на високо поле без течен хелий“ (Cryogenic LTD) в магнитни полета ± 3 T при температура 300 K.

За изследване на реактивността на Ni NTs в разтвори с различни стойности на рН са избрани три водни разтвора, вариращи от рH = 1 (силно киселинен) до 7 (неутрален). Регулирането на киселинността на разтвора се извършва чрез добавяне на солна киселина. NT се държат в разтвора с различни рH за времето до 20 дни.

Функционирането на амините на повърхността на NT се извършва чрез добавяне на 1 ml Ni NT (3-аминопропил) триметоксисилан с концентрация 2 и 20 тМ в етанол. Реакционната смес се поставя в ултразвукова баня за 1-2 минути и след това NT се държат в тези разтвори в продължение на 12 часа при стайна температура. След функционализирането на амините на Ni NTs, пробите се промиват в етанол и се сушат на въздух.

Свързването на багрилото с аминогрупите на повърхността на Ni NTs се извършва в 500 mM/l разтвор на кисело оранжево багрило (в HCl разтвор с рH = 3) в продължение на 12 часа. Пробите се отстраняват от разтвора след свързване, два пъти се промиват с разтвор на НС1 (рН = 3) и се сушат. Десорбцията на всяка проба се извършва в 3 ml разтвор на NaOH (рН = 12) в продължение на 15 минути на шейкъра. Концентрацията на амино групи се определя от спектрофотометрични измервания чрез UV Specord 250 Plus Analytik Jena, като се използва калибрационната графика. Измерването беше проведено при максимума на абсорбция на оцветителя Acid Orange, 495 nm.

За да се свърже протеин (говежди серумен албумин (BSA)) с аминираната повърхност, NT прахът се добавя към 500 микролитра ацетатен буфер (рН = 4,7–4,8) и след това към 100 μ1 от 0,1 М алкохолен разтвор на N- (3-диметиламинопропил) -N'-етилкарбодиимид хидрохлорид (EDC), 200 μ1 от 0,1 М разтвор на пентафлуорофенол (PFP) и 100 μ1 разтвор на BSA (0,1 mg/ml). Реакционната колба се поставя в ултразвуковата баня за 1-2 минути за по-добро смесване на NT и допълнителна реакция за 8 часа при 24 ° С. След завършване на реакцията пробите се измиват с етанол и се сушат при 40-50 ° С.

3. Резултати и дискусия

Никеловите NT са синтезирани в порите на PET мембрани с йонни следи чрез електроосаждане. В процеса на отлагане катодът представлява 10 nm дебел златен филм, разпръснат върху задната повърхност (не взаимодействащ с електролита) от PET шаблон. Дебелината на златния филм поддържаше отворени пори и растежът на NT започва в местата на контакт на златото с електролита, както е схематично показано на Фигура 1 (а). По време на процеса на разпрашаване златни частици попаднаха вътре в порите и образуваха златен пръстен около порите. Излизайки отвъд ръба на порите, електродът определя формата на образуваните наноструктури в началните етапи на синтез.


Фигура 1 (b) показва характерните стойности на зависимостта от времето на тока на отлагане (

) на време. В началото на процеса достига максимална стойност, след което рязко пада и достига плато. Постоянно Аз стойност е запазена до 250 секунди, след което настъпва нарастване на тока на отлагане. Това Аз поведението може да се обясни с факта, че процесът на галванизиране на метали в маскираните матрични пори включва следните четири етапа [26–31]: (I) етап на зародиш; (II) етапа на интензивния растеж на NT; (III) етапа на формиране на „капачките“ в горната част на NTs; (IV) етапът на непрекъснато образуване на метален филм върху повърхността на маската (Фигура 1 (в)). SEM изображения, съответстващи на етапите на отлагане (I) - (III), са показани на фигура 2.

Вижда се, че образуването на NT се случва само на двата първи етапа от процеса на електроосаждане, които са показани на фигура 1 (b). Първият етап съответства на началото на запълването на порите на шаблона. Когато напрежението се подава, на пръстеновидния електрод в долната пореста част се появяват метални ядра, които възпроизвеждат формата на електрода, образуват пръстен около златен катод и задават тръбната форма на NSs (Фигура 2 (а)). Ядрата се появяват едновременно в активни зони на повърхностите на стените на порите, които съдържат дефекти, висящи връзки и т.н. тези активни зони са резултат от химическо или физическо активиране, например, в процеса на образуване на пори в мембраните, гравирани с йонни следи и UV сенсибилизация [32]. Интензивното образуване на ядра намалява концентрацията на метални йони вътре в порите и следователно води до значително намаляване на тока на отлагане (виж фигура 1 (b)).

На втория етап, Аз постепенно намалява или остава почти постоянен (Фигура 1 (b)), което съответства на растежа на NTs директно вътре в порите (Фигура 2 (b)). Този процес е настъпил, докато NT достигнат повърхността на шаблона и се образуват „капачки“ в горната част на NT (Фигура 2 (c)). Тъй като дифузията на йони в порите се случва доста бавно, NT растат за сметка на последователното наслагване на двумерни ядра върху повърхността на пръстеновидната част [33]. Отлагането на двуизмерни слоеве води до образуването на кристалната NTs структура. Трябва да се отбележи, че влиянието на параметрите на електроосаждане върху структурно-морфологичните характеристики на Ni NTs е подробно обсъдено в нашата работа [24].

Анализът на SEM (Фигура 2) и TEM изображения (Фигура 3 (а)) показва, че образуваните NSs имат куха форма и позволяват да се определят външните диаметри на Ni NTs, равни на 400 nm по цялата дължина с отклонения в рамките на 5-7% от средните стойности. Дебелината на стената може да се изчисли чрез TEM изображения (

120 nm), но разделителната му способност не е подходяща за калибриране. Ето защо вътрешните диаметри от 180 nm са установени чрез метод на газопропускливост, който съответства на дебелината на стената от 110 nm. Анализът на EDS спектрите показа, че структурата на NT се състои от чист никел.

Кристалната структура на Ni NTs беше изследвана въз основа на SAED анализа за отделни NT (вмъкнете на фигура 3 (а)) и рентгеновите дифракционни спектри на NT масиви в PET шаблон (Фигура 3 (b)). NTs предпочитат посоката на растежа (111), което се потвърждава и от голямото съотношение на пиковете (111) и (200) в рентгеновите дифракционни спектри. XRD моделът, записан при дифракционни ъгли 2θ

Å и средният размер на кристалите е nm.

Степента на текстуриране на кристалита, съставляваща NT, се определя чрез изучаване на коефициентите на текстурата TC (hkl), които бяха изчислени по формулата на Харис [35]. Изчисленията показаха това TC (hkl) в 2θ = 44,559 ° е равно на 1,5741, а при 2θ = 51.930 ° TC (hkl) = 0,6741. Получените стойности за стойностите на коефициентите на текстурата показват наличието на доминираща посока

в структурата на Ni NTs.

Измервания на зависимостта от намагнитването от магнитното поле М(З.) са изследвани за паралелни и перпендикулярни посоки на полето по отношение на ориентацията на оста NTs (Фигура 4). Въз основа на хистерезисните контури основните магнитни характеристики (

: определя се намагнитването на насищане и /: съотношението на квадратността на хистерезисната верига).


Изследването на намагнитването на Ni NTs масиви показва, че ходът на хистерезисната верига е подобен на поведението на нанопроводи в магнитно поле [36]. Трябва да се отбележи, че контурът, измерен в различни посоки на магнитното поле спрямо главната ос на NT, има различен характер, което показва наличието на магнитната анизотропия в пробите: принудителност и стойност на квадратура за паралелна ориентация (

) на полето спрямо оста NTs е няколко пъти по-висока от стойностите за перпендикулярната посока на полето (

Oe, /). Анизотропията на магнитните свойства може да бъде дефинирана или чрез кристална анизотропия, открита при рентгеновия анализ, или чрез анизотропия на формата, причинена от факта, че във външно магнитно поле NTs с високо съотношение на страните (

100) се нуждаят от по-висока енергия на размагнитване по тяхната ос, отколкото в перпендикулярната посока на полето [15, 17].

Трябва да се отбележи, че две състояния са енергийно благоприятни (стабилни) поради липсата на магнитно ядро ​​в NT, когато линиите на магнитното поле са насочени по оста на тръбата или когато са затворени вътре в стените в посоката, перпендикулярна на оста . Хомогенността на магнитните свойства на NT осигурява предсказуемост на поведението в магнитно поле, което позволява да се контролира посоката и скоростта на движение в течности, включително биологични. Освен това получените наноструктури имат малко остатъчно намагнитване, което значително намалява вероятността от образуване на конгломерат на NT, които са в свободно състояние.

Една от най-важните характеристики на магнитните NT за тяхното приложение като магнитни носители за целенасочена доставка е реактивността и скоростта на окисляване и разграждане в среди с различна стойност на pH. Нашите проучвания бяха проведени в разтвори със стойности на pH 1, 5 и 7, което съответства на стойността на pH на човешкото тяло (киселинността на течностите в повечето органи в човешкото тяло е в диапазона 4-8, с изключение на стомашната киселинност, която е около 1). По този начин, в симулирана биологична среда, успяхме да получим данни за промените в структурата на Ni NTs през времето, когато те са били в човешкото тяло. Промяната в разграждането на повърхностните нанотръби е изследвана под въздействието на среди с различни нива на киселинност както чрез SEM, така и чрез EDS анализ. Оценката на морфологията и състава на Ni NT за времето до 20 дни е показана на Фигура 5.


Най-голямото разграждане на стените на NT се наблюдава при кисели среди с рH = 1. На десетия ден с pH = 1 се наблюдава образуване на хлабави аморфни области от външната страна на стените на нанотръбите, състоящи се от оксидни никелови съединения със съдържание на кислород около 18%. След 20 дни се наблюдава увеличаване на площта на аморфните райони и нарастващото съдържание на атомен кислород в структурата на нанотръбите до 36%, което води до частично срутване на стените. С настоящия анализ EDS и XRD показа, че образуваните аморфни области се състоят от оксидни съединения NiO и Ni2O3, които са токсични и вредни за органичните клетки, според [20].

Наблюдава се появата на кислород в структурата на петия ден за среди с рH = 5 и рH = 7 според EDS; обаче според XRD оксидните съединения в кристалната структура се появяват на десетия ден. Малко количество кислородни примеси през петия ден се дължат на окисляването на повърхностния слой NTs. На двадесетия ден съдържанието на кислород в структурата е съответно 17% и 9% за рH = 5 и рH = 7. На двадесетия ден за рН = 5 се наблюдава образуване на аморфни области, причиняващи частично разрушаване на структурата на нанотръбите. За рH = 7 се наблюдава образуване на възли на повърхността на тръбата, чийто среден размер е 30–35 nm, състоящ се от никелов оксид съгласно EDS и XRD.

По този начин, въз основа на получените данни, можем да докажем, че дългосрочното присъствие на Ni NSs (повече от един ден) в кисела среда провокира дълбоко разграждане на стените на NT до разрушаването. Вземайки предвид факта, че Ni оксидите (II) и (III) са токсични за хората, NTs трябва да бъдат покрити преди употреба в биомедицина с устойчивост на слоеве за биоразграждане (например злато, полимери и силан). Трябва да се отбележи, че кратките, по-малко от един ден, процеси (извличане на NT от шаблони и други видове обработка) бяха придружени с леки структурни промени на повърхността на Ni NTs. Образуването на никелови оксиди на повърхността на NTs улеснява неговото функционализиране за следните прикачени полезни товари.

Функционирането на амините на повърхността на Ni NTs се извършва чрез използване на органосилициево съединение (3-аминопропил) триметоксисилан. Процесът се основава на химическата инертност на Si-C връзките и високата реакционна способност на Si-O връзката, която лесно се подлага на хидролиза и реагира с NH-завършени NT повърхности. Кремнийорганичните съединения имат ниска токсичност и LD50 може да достигне 5000 mg/kg. Процесът на аминиране е схематично показан на Фигура 6 (а).