J.A.B. и X.L. допринесе еднакво за тази работа.

протеин

Джесика А. Белсер, Сюхуа Лу, Кристи Дж. Шретер, Сяопин Джин, Лора М. Ашенбреннер, Алис Лий, Стивън Хоули, До Хьонг Ким, Майкъл П. Малахов, Манг Ю, Фанг Фанг, Жаклин М. Кац, DAS181, A Нов синтетичен протеин на сиалидаза, предпазва мишките от летална инфлуенца по птичия грип H5N1, заразяване с вируси, Вестник за инфекциозни болести, том 196, брой 10, 15 ноември 2007 г., страници 1493–1499, https://doi.org/10.1086/522609

Резюме

Нарастващата резистентност към наличните в момента грипни антивирусни средства подчертава необходимостта от разработване на алтернативни подходи за профилактика и/или лечение на грип. DAS181 (Fludase), нов синтетичен протеин на сиалидаза, който ензимно премахва сиаловите киселини върху дихателния епител, проявява мощна антивирусна активност срещу грипни вируси А и В. Тук използваме модел на мишка, за да оценим ефикасността на лечението с DAS181 срещу силно патогенен вирус на птичия грип H5N1. Когато се използва за лечение на мишки ежедневно, започвайки 1 ден преди инфекция с A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) вирус, лечението с DAS181 при 1 mg/kg/ден предпазва 100% от мишките от фатално заболяване, предотвратява вирусно разпространение в мозъка и ефективно блокира инфекцията при 70% от мишките. DAS181 при 1 mg/kg/ден също е ефективен терапевтично, осигурявайки повишена преживяемост на мишки, предизвикани от вируса на H5N1, когато лечението е започнало 72 часа след инфекцията. Тази забележителна антивирусна активност подчертава потенциалната полезност на DAS181 като нов клас лекарства, които са ефективни срещу грипни вируси с пандемичен потенциал.

От края на 2003 г. високопатогенните вируси на птичи грип (HPAI) H5N1 са опустошили популациите от домашни птици в Азия, Европа и Африка и са причинили> 300 лабораторно потвърдени инфекции при хора, със смъртност of 60% [1]. Тези събития подчертават потенциала за пандемичен щам, като H5N1, да възникне от птичи видове. В такъв случай ефективните антивирусни лекарства ще бъдат съществена контролна мярка, особено в първите етапи на пандемия, когато антигенно добре съчетани ваксини все още не са налични [2]. Понастоящем лицензираните противогрипни лекарства се състоят от блокерите на йонните канали на адамантин М2 и инхибиторите на невраминидазата, оселтамивир и занамивир [3, 4]. За съжаление, по-голямата част от клада 1 и някои вируси от клада 2 H5N1, циркулиращи в Югоизточна Азия, са устойчиви на блокерите на М2 [5–8]. Изолирането на квазивидове, които включват резистентни на оселтамивир варианти от пациенти, заразени с вируса H5N1, породи допълнителни опасения, че съществуващите антивирусни механизми за вируси H5N1 са неадекватни [9, 10], и подчертава необходимостта от разработване на нови терапевтични агенти, които са ефективни срещу вирусите на инфлуенцата по птиците с пандемичен потенциал [11].

Грипните вируси инициират инфекция чрез свързване с крайни рецептори на сиалова киселина върху гликоконюгати на повърхността на чувствителни клетки гостоприемници. Следователно, лекарство със сиалидазна активност, което може да премахне наличните рецептори върху епитела на човешките дихателни пътища, има потенциал да предотврати или намали инфекциозността на множество грипни подтипове. DAS181 (Fludase) е рекомбинантен хибриден протеин, състоящ се от каталитичен домен на сиалидаза, получен от Actinomyces viscosus, слят с дихателен епител - закрепващ домейн, който свързва лекарството с мястото на грипната вирусна инфекция при хората и разцепва както α (2,6) - свързани и (2,3) -свързани рецептори на сиалова киселина, които са предпочитано разпознати от вирусите на човешкия и птичия/конски грип, съответно [12]. DAS181 проявява мощна антивирусна активност срещу вируси на грип А и В ин витро и намалява репликацията на вируси H1N1 при мишки и порове [12]. Въпреки това, in vivo активността на лекарството срещу вируси на инфлуенца по птиците с пандемичен потенциал не е известна. Тук демонстрираме, че DAS181 може ефективно да предпази мишките от летална болест, значително да намали репликацията на вируса и дори да предотврати инфекция с HPAI H5N1 вирус.

Материали и методи

Вирус. Вирусът HPAI A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (оттук нататък VN/1203) е отгледан в алантоисната кухина на 10-дневни зародиши кокоши яйца при 37 ° C. Алантоевата течност се събира 26 часа след инокулацията и се съхранява в аликвотни части при -70 ° С. EID50titer се определя чрез серийно титруване на вируса в яйцата и се изчислява по метода на Reed and Muench [13]. Всички експерименти с високо патогенни вируси бяха проведени при ограничаване на ниво 3 по биобезопасност, включително подобрения, изисквани от Министерството на земеделието на САЩ и програмата Select Agent [14]. Лабораторните работници носеха подходящо дихателно оборудване през цялото време (RACAL Health and Safety). Изследванията върху животни са одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните при Центровете за контрол и превенция на заболяванията и са проведени в Асоциация за оценка и акредитация на Laboratory Animal Care International - акредитирана организация за животни.

Инфекция на мишки и предизвикателни експерименти. Шест до осем седмици женски мишки BALB/c (Charles River Laboratories) бяха леко анестезирани с CO2 и 50 μ инфекциозен вирус, разреден в PBS, бяха инокулирани интраназално (inl). MLD50 на VN/1203 се определя, както е описано другаде [15]. За да се оцени степента на лекарствена ефикасност, мишките бяха предизвикани inl с 3 MLD50 (1 × 10 2.3 EID50) или 1.5 MLD50 (1 × 10 2.0 EID50) от VN/1203. Три до пет мишки на група бяха убити 6 или 9 дни след инфекцията. Белодробните и мозъчните тъкани бяха събрани и титрувани за вирус, както е описано другаде [15]. Накратко, цели бели дробове и мозъци бяха събрани и хомогенизирани в 1 ml PBS, избистрени чрез центрофугиране и серийно титрувани в яйца. Титрите на вируса са изразени като средно ± SE log10 EID50/mL. Останалите 12–20 мишки от всяка група се наблюдават ежедневно за загуба на тегло и оцеляване в продължение на 21 дни.

Лечение на мишки с DAS181. Мишките BALB/c се анестезират чрез интраперитонеална инжекция със 100 mg/kg кетамин преди лечение с DAS181 или плацебо (стерилен PBS); 10 U (8 μig) или 30 U (23 μg) от DAS181 или PBS се доставят в дихателната лигавица в обем от 50 μL веднъж или два пъти дневно в продължение на общо 7 или 8 дни. Една единица DAS181 е еквивалентна на 0,77 μg протеин. За да се оцени профилактичната и терапевтичната ефикасност на DAS181 срещу HPAI H5N1 вирус, мишките бяха лекувани с DAS181, започвайки 24 часа преди или 24, 48 или 72 часа след inl инфекция с VN/1203.

Блокиране на грипна вирусна инфекция при мишки след профилактично приложение на DAS181. За да се оцени степента, до която мишките, администрирани DAS181, всъщност са заразени с вируса H5N1, ние определихме нивата на H5-специфично HI или IgG антитяло в серумни проби, събрани от оцелели мишки (таблица 1 и фигура 2). H5-специфично антитяло е открито при повечето оцелели, които са получавали DAS181 при 0,3 или 0,7 mg/kg/ден, но само при една трета от оцелелите, които са получавали DAS181 при 1 mg/kg/ден, което показва, че повечето мишки, получаващи това дози не са били инфектирани продуктивно с VN/1203. Този ефект се наблюдава при дозата на предизвикателство VN/1203. Тези резултати показват, че ежедневното вътрешно доставяне на DAS181 значително намалява репликацията и разпространението на вируса H5N1 и при доза от 1 mg/kg/ден предпазва 100% от мишките от смърт и по-голямата част от мишките от инфекция с силно вирулентен вирус H5N1.

Хемаглутинин (HA) - специфични инхибиране на хемаглутинацията (HI) и IgG антитела (Ab) в серума от мишки, оцелели с високо вирулентен вирус H5N1. Взети са серумни проби от мишки, които са били лекувани с DAS181, както е посочено и които са оцелели с 3 или 1,5 MLD50 на вируса A/Vietnam/1203/2004 (H5N1); пробите бяха тествани за наличие на HI Ab (A и B) и IgG Ab чрез ELISA (C и D). Положителният резултат от ELISA се счита за доказателство за продуктивна инфекция с H5N1 при мишки. Границата на откриване за IgG Ab титър е 100. HI Ab титрите ⩾40 (log2 5.32) отразяват 4-кратно покачване над това в преинфекционен серум и се считат за положителни. tControl мишки, лекувани с PBS, не оцеляват до 4 седмици след инфекцията.

Хемаглутинин (HA) - специфични инхибиране на хемаглутинацията (HI) и IgG антитела (Ab) в серума от мишки, оцелели с високо вирулентен вирус H5N1. Взети са серумни проби от мишки, които са били лекувани с DAS181, както е посочено и които са оцелели с 3 или 1,5 MLD50 на вируса A/Vietnam/1203/2004 (H5N1); пробите бяха тествани за наличие на HI Ab (A и B) и IgG Ab чрез ELISA (C и D). Положителният резултат от ELISA се счита за доказателство за продуктивна инфекция с H5N1 при мишки. Границата на откриване за IgG Ab титър е 100. HI Ab титрите ⩾40 (log2 5.32) отразяват 4-кратно покачване над това в преинфекционен серум и се считат за положителни. tControl мишки, лекувани с PBS, не оцеляват до 4 седмици след инфекцията.

Терапевтична ефикасност на DAS181 срещу силно вирулентен вирус H5N1 при мишки. След това оценихме терапевтичната активност на inl DAS181 при 1 mg/kg/ден, когато лечението беше започнато 24, 48 или 72 часа след предизвикване с 3 MLD50 от VN/1203. Като контрола за антивирусна ефикасност, една група мишки получават лекарство с 1 mg/kg/ден, започвайки 24 часа преди предизвикване; тази група показва 95% степен на оцеляване, подобна на тази, наблюдавана в предишния експеримент. Терапевтичното приложение на DAS181 не е в състояние да предпази мишките от инфекция с VN/1203, както се демонстрира от значителна загуба на тегло между групите, която не е била статистически значима независимо от деня на започване на лечението. Когато лечението е било отложено до 24 часа след инфекцията, мишките са показали значителна загуба на тегло, но са имали значително забавено средно време до смърт в сравнение с третираната група (P таблица 2 и фигура 3А).

Оцеляване при мишки, терапевтично администрирани DAS181 след смъртоносна атака с вирус A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (VN/1203).

Оцеляване при мишки, терапевтично администрирани DAS181 след смъртоносна атака с вирус A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (VN/1203).

Дискусия

Високата вирусна тежест е замесена като критична характеристика на патогенезата на вируса H5N1 при хората [20], което предполага, че клиничното управление на човешкото заболяване H5N1 трябва да се съсредоточи върху потискането на репликацията на вируса чрез използването на ефективни антивирусни средства. В настоящото проучване демонстрирахме, че новият синтезиран протеин на сиалидаза DAS181 има дозозависима антивирусна активност при мишки срещу силно вирулентен вирус H5N1, изолиран от човек със фатален случай на грип. Когато се доставя преди предизвикване в доза от 1 mg/kg/ден, DAS181 не само предпазва мишките от смъртоносна болест, но напълно блокира инфекцията при ~ 70% от мишките. DAS181 също е ефективен, когато се прилага след предизвикване. Най-важното е, че след 7-дневен режим на лечение не е имало значително увеличение на вирусните титри след прекратяване на лечението.

Докато понастоящем наличните грипни антивирусни лечения са насочени към вирусни генни продукти, DAS181 е насочен към приемни клетъчни рецептори, което може да предложи намалена възможност за появата на резистентност. Независимо от това, ще бъде важно внимателно да се оцени потенциалът за избор на рецептор-свързващи варианти след лечение с DAS181. Забележителната in vivo ефикасност срещу силно вирулентен птичи вирус H5N1 подчертава потенциала на DAS181 като ефективно антивирусно средство както за сезонен, така и за пандемичен грип. Фаза 1 клинично изпитване на DAS181 ще започне в края на 2007 г.

Благодарности

Благодарим на Лариса Губарева за критичния преглед на ръкописа.