doi: 10.18527/2500-2236-2017-4-1-52-57

ефект

получено: 2017-12-01 приети: 2018-02-09 публикувано: 2018-02-22

Ирина А. Ленева 1 #, Ирина Н. Фалинскова 1, Найля Р. Махмудова 1, Екатерина А. Глубокова 1, Надежда П. Карташова 1, Евгения И. Леонова 1, Наталия А. Михайлова 1, Ирина В. Шестакова 2

1 Изследователски институт за ваксини и серуми на Мечников, Москва, Руска федерация
2 Евдокимов държавен университет по медицина и стоматология, Москва, Руска федерация
# Автор-кореспондент: Ирина Ленева, e-mail: [email protected]

Резюме

Въведение

Новото оригинално лекарство, което принадлежи към азолоазиновия клас съединения, триазавирин (аналог на пуринов нуклеотид гуанин), е лицензирано в Русия [15]. Това лекарство е разработено съвместно от учените от Уралския държавен политехнически университет (Екатеринбург, Русия), Института за органичен синтез Постовски (Екатеринбург, Русия) и Изследователския институт по грип (Санкт Петербург, Русия). Триазавиринът има широк спектър на антивирусна активност и е ефективен срещу редица остри респираторни вирусни инфекции, включително грип А и В. Целта на този проект е да се проучи ефикасността на триазавирин срещу вторична бактериална пневмония след грип при мишки.

Материали и методи

Съединения

Триазавирин (2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-с] -1,2,4-триазин-7 (4I´) -он) е предоставен от Medsynthesis (Русия) (Фиг. . 1А) [15].

Оселтамивир фосфат (етил (3R, 4R, 5S) -4-ацетамидо-5-амино-3- (пентан-3-илокси) циклохекс-1-ен-1-карбоксилат фосфат) (фиг. 1В) е подарък от Chemical Diversity, Inc. (Сан-Диего, САЩ). Умифеновир (етил 6-бромо-4 - [(диметиламино) метил] -5-хидрокси-1-метил-2 - [(фенилтио) метил)] - 1Н-индол-3-карбоксилат) (фиг. 1С) се осигурява от Pharmstandard (Русия). Оселтамивир фосфат и триазавирин се разтварят в стерилна дестилирана вода. За перорално доставяне на мишки, умифеновир е суспендиран в 1% разтвор на нишесте. За всеки експеримент бяха използвани прясно приготвените разтвори на лекарства.

Клетки и грипни вируси

Клетките на кучешки бъбреци Madin Darby (MDCK) се отглеждат при 37 ° C в овлажнена атмосфера от 5% CO2 в минимална съществена среда (MEM), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS), 5 mM L-глутамин, 25 mM HEPES, 100 U/ml пеницилин, 100 μg/ml стрептомицин сулфат и 100 μg/ml канамицин сулфат. Грипният вирус A/California/04/2009 (H1N1) pdm09 (A/CA/04/09) е предоставен от сътрудничещия център на СЗО - Изследователски институт по грип (Санкт Петербург, Русия). Вирусът се размножава в зародишни пилешки яйца (CE). Вирусният инфекциозен титър се определя чрез титруване в СЕ и се изразява като десетичен логаритъм от ембрионирани инфекциозни дози (log10EID50/ml). Щамът S. aureus 1986 е получен от колекцията на Института за ваксини и серуми на Мечников (Москва, Русия). Бактериите се размножават върху триптичен соев агар.

Оценка на лекарствената ефикасност при модели на мишки

Женски мишки BALB/c, получени от Научния център по биомедицински технологии на Руската академия на науките (Andreevka, Московска област, Русия) с тегло приблизително 12 до 14 g, бяха поставени под карантина и аклиматизирани за 3 дни преди употреба. Мишките бяха настанени в клетки и използвани за лечение в групи от 13 животни. Всички проучвания са одобрени от Изследователския институт по ваксини и Sera Комитет по етика на опитите с животни и са проведени в строго съответствие с приложимите закони и насоки.

За инфекция с животни адаптиран към мишки вирус A/CA/04/09 беше получен чрез 3 последващи пасажи в белите дробове на мишката. За да се изследва ефикасността на лекарствата срещу грипна инфекция, мишките бяха интраназално (т.е.) предизвикани със смъртоносна доза на мишка (MLD80/0,1 ml), която е равна на 4,0 log10EID50/0,1 ml) от вируса A/CA/04/09. В експериментите, занимаващи се с вторична бактериална пневмония след грип, животните са заразени i.n. с 0,5 MLD50/0,1 ml адаптиран към мишки вирус A/CA/04/09. Запасите от S. aureus се отглеждат през нощта в триптичен соев бульон при 37 ° С и се разреждат в стерилен PBS до 2х10 10 от образуващи колонии единици (CFU/0,1 ml) преди употреба. Предизвикателство на S. aureus беше извършено i.n. на 4-ия ден след вирусната инфекция. Преди интраназалното доставяне на инфекциозни агенти, животните бяха леко упоени с етер.

Белодробен преглед

3 мишки от всяка група бяха евтаназирани на 4-ия или 7-ия ден след вирусна инфекция от групите, заразени само с вирус и съответно с вируса и бактериите. Вирусните титри и броят на бактериите са оценени в белите дробове. Белодробните хомогенати се приготвят, въртят се при 10 g в продължение на 5 минути и супернатантите се използват за определяне на титрите на вируса и/или броя на бактериите. Количественото определяне на колониите на S. aureus се извършва в десетократни разреждания на белодробен супернатант, добавен към триптични плочи от соев агар, допълнени с 3% овчи еритроцити (обем/обем). Идентифицирането на колониите е извършено чрез визуална проверка. Титрите на вируса бяха определени чрез титруване на белодробни хомогенати върху MDCK клетъчни монослоеве и изразени като десетичен логаритъм на инфекциозни дози от тъканна култура (log10TCID50/ml).

Резултати

Ефективност на триазавирин при мишки, заразени с грипен вирус

Лечение

MSD

Титър на вируса в белите дробове на ден 4 p.i.,
log10TCID50/ml a

Бактериална плътност в белите дробове,
 CFU/ml a

1. A/CA/04/09 + S. aureus + триазавирин 25 mg/kg/ден

2. A/CA/04/09 + S. aureus + триазавирин 50 mg/kg/ден

3. A/CA/04/09 + S. aureus + триазавирин 100 mg/kg/ден

4. A/CA/04/09 + S. aureus + оселтамивир 10 mg/kg/ден

5. A/CA/04/09 + S. aureus + умифеновир 60 mg/kg/ден

6. A/CA/04/09 + S. aureus

a Данните са дадени като M ± SD.
(†) Разликата е значителна в сравнение с групата, заразена само с вируса A/CA/04/09, t-тест на Student, p

Пневмонията често се появява като усложнение след грипната инфекция и представлява голяма част от заболеваемостта и смъртността, свързани със сезонни и пандемични огнища на грип [5, 7]. Само антибиотичната терапия може да не е най-ефективното лечение за тази двойна инфекция. Въпреки това, антивирусната терапия често е пренебрегвана, тъй като вирусните инфекции обикновено се решават до момента на възникване на бактериалната пневмония. По-рано беше показано, че антивирусното лечение с озелтамивир и умифеновир подобрява резултата от вторичната бактериална пневмония след грип в миши модел [12-14]. Клиничните изпитвания също потвърждават този ефект и показват, че антивирусното лечение на грип намалява риска от усложнения след грип [16].

В настоящото проучване антивирусното съединение триазавирин е тествано в миши модел на вторична бактериална пневмония след грип в сравнение с миши модел на грипна пневмония. Лечението с триазавирин в миши летален модел на грип не беше високо ефективно и само при най-ниската доза 25 mg/kg/ден доведе до статистически значимо подобрение на степента на преживяемост на животните и удължаване на средното време на преживяване. Прилагането на триазавирин в тази доза също предотвратява загубата на тегло при заразените животни. Ефикасността на лечението с триазавирин намалява с увеличаване на дозата на лекарството и при 100 mg/kg/ден - най-високата от изследваните дози - триазавирин изобщо не е ефективен при този модел.

Разликата, наблюдавана в експериментите с триазавирин в два модела, може да се обясни и с механизма на действие на това лекарство. Както беше показано по-рано [15], триазавиринът, като гуанинов аналог, е селективен инхибитор на грипни РНК полимеразни комплекси. Освен това има някои данни за неговия плейотропен механизъм на действие. Показано е, че триазавиринът влияе върху образуването на амилоидоподобни влакна на моделния пептид (SI), което определя патогенезата на конформационните заболявания [17]. Освен това амилоидоподобните олигомери могат да действат и като преобразуватели на сигнал в здрави и заразени организми [18].

Грипно-бактериалната коинфекция е многофакторен процес, който включва различни патогенни фактори на вируса и бактериите, както и отговорите на гостоприемника. Всички тези фактори трябва да бъдат взети под внимание при разглеждане на честотата и патогенността на тези коинфекции. Експериментите върху животински модели подобриха нашето разбиране за това как грипните вируси взаимодействат с техните бактериални съпотогени и за придружаващия имунен отговор на гостоприемника. Резултатите от тези експерименти показват, че анормалният имунен отговор води до тежко възпаление, ключов двигател за придобиване на бактерии и тежест на инфекцията след грип [5, 11].

Следователно, употребата на антивирусни средства като триазавирин, които потискат репликацията на вируса и значително увеличават оцеляването на животните с комбиниран вирус - бактериална инфекция, може да намали тежестта на вторична бактериална инфекция на организма гостоприемник и може да бъде нов метод за предотвратяване и лекуват свързани с грип бактериални коинфекции. Необходими са допълнителни проучвания, за да се потвърди този ефект при хората.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират търговски или финансов конфликт на интереси.