Субекти

Резюме

Въведение

Разстройствата от аутистичния спектър (ASD) са нарушения на невроразвитието, характеризиращи се с нарушено социално взаимодействие, дефицит в комуникацията, повтарящо се поведение и тесни и интензивни интереси. 1 Различни генетични изследвания предполагат връзката на ASD с аномалии в клетъчните пътища, свързани с постсинаптичните глутаматергични синапси. 2, 3 Повишена дендритна плътност на гръбначния стълб е установена в мозъка на ASD 4 и се наблюдават анормални синаптични структури при ASD мишки. 5

Постнаталното синаптично развитие се регулира динамично от едновременното образуване и елиминиране на синапса в кората на мозъка на бозайниците. 6, 7 Излишъкът от синапси се формира в началото на развитието, повече от това, което обикновено се поддържа в зрелия мозък. Впоследствие допълнителните и ненужни синапси се елиминират и подгрупа от синапси се поддържа и укрепва. 8, 9 Следователно, прецизното регулиране на образуването и елиминирането на синапсите е важно за нормалното развитие на мозъка, а редуцираното елиминиране на синапсите, водещо до излишък, се смята, че е свързано с невроразвитие, като ASD. 10, 11

Все повече доказателства предполагат централна роля за имунната дисрегулация при ASD. Няколко гена за риск от ASD са свързани с имунната система, а свързаните с майчината имунна система рискови фактори са свързани с ASD. 12 Microglia, представителна имунна клетка в мозъка, играе важна роля в синаптичното усъвършенстване 10, 13, 14, 15 и също така се смята, че участва в патогенезата на ASD. 12, 16, 17, 18, 19, 20 Много доклади също показват промени в активирането, количеството и разпределението на микроглията в мозъка на ASD. 17, 18, 19, 21

Различни проучвания предполагат, че пътищата на автофагия участват в патогенезата на ASD. Съобщени са 22 варианта на екзонично число на копие на ASD в гените, кодиращи протеини, участващи в пътищата на автофагия. 23 Автофагията е катаболният процес, който отделя цитоплазмата, включително аберантни органели и макромолекули, в двумембранни везикули и я доставя в лизозомите за разграждане и евентуално рециклиране на получените макромолекули. 24 Целта на рапамицин при бозайници (mTOR) е един от важните инхибиторни регулатори на индуцирането на автофагия. 25, 26 Мишки с медиирана от мутация мутация на PTN дезинхибиране, която инхибира автофагията, показва аутистично поведение и анормална невронална арборизация, което предполага, че автофагията е дерегулирана при ASD. 27 Аутизъм-подобни фенотипове са наблюдавани при женски мишки без амбра-1, което е положителен регулатор на беклин-1, основен играч във формирането на автофагозоми. 28 Инхибиране на mTOR от рапамицин, който активира аутофагията, възстановява аутистичните симптоми и подобрява анормалните невроанатомични структури в PTEN мутантни мишки. 29, 30 Напоследък се наблюдава хиперактивиран mTOR и нарушена автофагия посмъртно темпорална кора на пациенти с ASD. 11.

Съответно предположихме, че автофагичните процеси на микроглията могат да участват в синаптичното подрязване и се замислихме дали микроглиалната автофагия също е важна при аутистичното поведение. Въпреки че глията е много по-обилна в мозъка и наскоро беше установено, че има по-важна роля в регулирането на синаптичната активност и поддържането на хомеостазата на мозъка, отколкото се смяташе досега, 19, 23, връзката между микроглиалната автофагия и ASD остава да бъде изяснено.

Материали и методи

Животни

Тестове за поведение на мишката

Подробни материали и методи са предоставени в допълнителната информация.

Клетъчни култури

Микроглиите са изолирани от смесени първични глиални култури, които са получени от мозъчните кори на 3-дневни мишки, както е описано по-рано. 31 Първични култури на кортикални неврони на мишка са приготвени от мозъка на малките ембрионални 16-ти ден, както е описано по-рано. 32 Подробни материали и методи са предоставени в допълнителната информация.

Western blot и други експерименти

Уестърн петна се провеждат съгласно стандартни методи при денатуриране и редуциране, както е описано по-горе. 33 Подробни материали и методи са предоставени в допълнителната информация.

Резултати

Поколение на мишки с микроглия с дефицит на Atg7

За да изследваме приноса на микроглиалната автофагия към синаптичното усъвършенстване и ASD, ние произведохме мишки Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre. При тези мишки Atg7, който е жизненоважен за автофагията, се изтрива в миелоидни линии, специфични за лизозим М-експресиращи клетки, както е описано по-горе. 34 Чрез кръстосване на Atg7 fl/fl; мишка Lyz2-Cre с мишки-репортери ROSA26-tdTomato, приютяващи последователности loxP-STOP-loxP преди td Домат ген, ние визуализирахме Creg-експресиращата микроглия. Както е показано в сагиталната равнина на Atg7 fl/+; Lyz2 Cre/+; ROSA26-tdTomato мозък на мишка в постнатален ден 7, експресиращи домати микроглии са открити във всички мозъчни региони (Фигура 1а) и колокализирани с Iba-1-положителна микроглия (Фигура 1б). Нивото на протеин на Atg7 в първично култивирана микроглия, както и в перитонеални макрофаги, събрани от Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишки или не се откриват, или са много ниски при Western blot анализ (Фигура 1в). Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишките са били нормално в развитието и плодородни. Възрастните не показват никакви разлики в телесното или мозъчното тегло в сравнение с контролите (Фигура 1г).

автофагия

Фенотипове на мишки с микроглия с дефицит на Atg7. (а) Сагитални изображения на Atg7 fl/+; Lyz2 Cre/+; ROSA26-tdTomato мозък на мишка в постнатален ден 7, оцветени с антитяло срещу Iba-1 (зелено) и Hoechst 33342 (синьо). Експресията на домати (червена) беше открита във всички мозъчни области. Мащабна лента = 500 μm. (б) По-голямата част от експресията на Домат (червена) е локализирана съвместно с Iba-1-положителна микроглия (зелена). Мащабна лента = 20 μm. (° С) Atg7 протеин не е открит в лизата на първичните култури на микроглия или в перитонеалните макрофаги, събрани от Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишка. (д) Тегло на тялото и мозъка на възрастни мишки Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишките са подобни на тези на контролите (н= 12 за всяка група).

Мишките с дефицит на Atg7 микроглия показват нарушено социално взаимодействие и повтарящо се поведение

Аутизмът се определя от нарушено социално взаимодействие и комуникация и повтарящо се поведение. Първо изследвахме дали мишките Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre показват ненормално социално взаимодействие. В трикамерния тест за социално взаимодействие, Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мъжки мишки не показват никакво предпочитание към непознат 1, докато контролните мъжки мишки прекарват значително повече време с непознат 1, отколкото с празната чаша, което показва, че Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишки показват аутистично нарушение на социалното взаимодействие (Фигура 2а). Когато празната чаша беше заета с друга нова мишка (непознат 2), и контролите, и Atg7 fl/fl; мишките Lyz2-Cre предпочитаха да изследват около непознат 2 (Фигура 2b). Нямаше разлики между групите в общото изминато разстояние по време на всеки тест (Фигури 2a – c). Подобно на мъжки мишки, женските мишки също показват недостатъчна общителност (допълнителна фигура S1). Тези резултати показват, че мишките с микрофлия с дефицит на автофагия имат нарушена общителност, но нормално социално разпознаване. След това оценихме теста за погребване на мрамор и поведението за изграждане на гнезда. Atg7 fl/fl; Мишките Lyz2-Cre заровиха повече топчета от контролите (Фигура 2г), отразявайки повишено повтарящо се поведение, което е една от характеристиките на ASD. Atg7 fl/fl; Мишките Lyz2-Cre също имат по-лоши резултати за изграждане на гнезда от контролите (Фигура 2д).

Повишена дендритна плътност на гръбначния стълб при мишки с микроглия с дефицит на Atg7

Отново потвърдихме по-висока имунореактивност на PSD95 в мозъчните секции на Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишки, отколкото в контролите (Фигура 3b). Чрез двойно маркиране с PSD95 антитяло и Iba-1 антитяло, открихме обилна ко-локализация на PSD95- и Iba-1-положителни имунореактивности при мишки Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre в сравнение с контролни животни. Когато се оцветяват с антитяло срещу синаптофизин, пресинаптичен маркер, Iba-1 и синаптофизин ко-локализации също се откриват по-често при Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишки, отколкото в контролите (Фигура 3b). На 12-ия ден след раждането ние количествено определихме броя на погълнатите PSD95-положителни точки на микроглия в кортикалната област (Фигура 3в). Погълнатите PSD95-положителни пункти бяха количествено определени в триизмерни проекции с висока разделителна способност на всяка микроглия, конструирани от конфокален z-стек. Броят на PSD95-положителни точки при Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишките са значително по-високи, отколкото при контролите (Фигура 3в).

При Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишки, нивата на протеини на автофагични маркери, включително LC3 (лека верига-3) -II и p62, са значително различни от тези на контролите (Фигура 3d). При анализ на Western blot, LC3-II, автофагозомен маркер, е значително намален при Atg7 fl/fl; Lyz2-cre мишки и p62, протеинов субстрат за автофагия, използван за проследяване на автофагичния обмен, 37 е значително увеличен, отразявайки нарушената автофагия в микроглия. Взети заедно, спекулирахме, че дефицитът на автофагия в микроглията по време на ранното развитие води до увеличаване на дендритните бодли, поради намаленото елиминиране, медиирано от автофагия.

Нарушено разграждане на синапсите и увеличен брой незрели синапси поради микроглия с дефицит на atg7

След това съвместно култивираме първични миши неврони с микроглия от Atg7 fl/fl или Atg7 fl/fl; мишки Lyz2-Cre, за да изследваме ефектите на микроглиалната автофагия върху развитието на невроните. Подобно на предишните резултати (фигури 3 и 4), натрупването на синаптофизин е по-силно изразено при микроглия с дефицит на atg7 (фигура 5а), което допълнително потвърждава нарушената деградация на синапса при микрофлия с дефицит на автофагия. Synaptophysin puncta са били увеличени в неврони, съвместно култивирани с микроглия с дефицит на atg7 (Фигура 5b), подобно на in vivo резултати (Фигура 3). MAP2-позитивните дендритни филоподии също бяха увеличени в неврони, съпътствани с микроглия с дефицит на atg7 (Фигура 5в), което предполага, че незрелите синапси са увеличени от микрофлия с дефицит на автофагия. Невроните, съвместно култивирани с микроглия с дефицит на atg7, също показват увеличена дебелина на неврита, образуване на невритни фасцикули и фрагментирани неврити (допълнителна фигура S2). Интересното е, че тези промени не винаги са били придружени от директен контакт с микроглията, което предполага, че има допълнителни хуморални фактори, влияещи върху развитието на синапса извън директния ефект на микроглиалната автофагия върху деградацията на синапса.

Промяна на анатомичната и функционална свързаност на мозъка при мишки с микрофлия с дефицит на автофагия

Тъй като недостатъчното сигнализиране на неврон-микроглия води до нарушена функционална свързаност на мозъка, 10 и невритни и синаптични промени са наблюдавани в невроните и мозъка на мишки с микроглия с дефицит на atg7 (Фигури 3, 4, 5 и допълнителна фигура S2), ние изследвахме мозъчната свързаност използване на дифузионно тензорно изобразяване и функционално ядрено-магнитен резонанс в състояние на покой (fMRI). В мозъците на Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre мишки средната дифузивност е увеличена в S2 (допълнителна фигура S3a). Това предполага, че има микроструктурни аномалии в няколко мозъчни области на Atg7 fl/fl; мишки Lyz2-Cre, които могат да повлияят на анатомичната и функционалната мозъчна свързаност и могат да отразяват невритните промени, наблюдавани при съвместна култура на неврони с микроглия с дефицит на atg7 (допълнително Фигура S2). Корелационните матрици, изчислени от глобалния анализ на сигнала fMRI BOLD, показват тенденция към променена функционална свързаност на fMRI от S2 към други области на кората. Функционалната свързаност беше увеличена от S2 до предната цингуларна кора и намалена от S2 до префронталната кора в Atg7 fl/fl; мишки Lyz2-cre в сравнение с контролни мишки (допълнителна фигура S3b). Това допълнително предполага, че нарушената микроглиална автофагия променя микроструктурата и функционалната свързаност на мозъка, което може да допринесе за патогенезата на ASD.

Дискусия

В настоящото проучване ние показваме, че за първи път вярваме, че загубата на автофагия в ранното развитие на микроглията влошава синаптичното подрязване и води до повишена дендритна плътност на гръбначния стълб и ненормалното социално взаимодействие и повтарящи се поведения, показателни за ASD. Следователно автофагията в микроглията играе важна роля в регулирането на синаптичната хомеостаза и невропсихологичното поведение (допълнителна фигура S5).

Предполага се, че автофагията участва в патогенезата на ASD. 22, 23 Танг и др. 11 наскоро откри, че автофагията е нарушена през посмъртно ASD временни корти, като показва, че автофагозомният маркер LC3-II е намален и че субстратът на автофагия p62 е увеличен. В допълнение се увеличава фосфорилирането на mTOR и неговия субстрат, което показва, че mTOR се активира и е в състояние да инхибира автофагията. Освен това те наблюдават дефекти в синаптичната резитба и ASD-подобно поведение при мишки с дефицит на невронална автофагия, показвайки, че невроналната автофагия е важна за регулиране на синаптичното усъвършенстване и нормалното развитие на мозъка. Освен това може да има и друг механизъм за синаптично подрязване, а именно, че микроглията елиминира слабите и неподходящи синапси чрез фагоцитоза по време на постнаталното развитие. 13, 15 Резултати, показващи нарушена автофагия в посмъртно ASD мозък 11 може да се дължи на нарушена автофагия не само в невроните, но и в глията, включително микроглията, тъй като глиите са по-богати от невроните. Тук показахме, че микроглиалната автофагия също е важна при синаптичното усъвършенстване и нормалното развитие на мозъка (Фигури 3, 4, 5). Нарушената микроглиална аутофагия може да допринесе за цялостното увреждане на автофагията в мозъка на пациенти с ASD. 11.

Преобладаването на ASD се различава при мъжете и жените. 60 Хетерозиготният дефицит на амбра-1 води до аутистично поведение само при женски мишки, но не и при мъжки мишки. Зависимият от активност невропротективен протеин (ADNP) е мутирал при пациенти с ASD и повечето мъжки деца с мутации, които към днешна дата показват по-тежки интелектуални увреждания от жените. 61, 62, 63 ADNP хаплоинсуфициентността води до тежко когнитивно увреждане при мъжки мишки, докато женските мишки са частично пощадени. 64, 65 Интересното е, че ADNP също се изразява в микроглия и се препоръчва да има компенсаторни защитни функции срещу стресови състояния. 66 Тези свойства също могат да бъдат нарушени от ASD мутации. Мъжете имат повече микроглия в определени мозъчни области, включително преоптичната област, хипокампуса, теменната кора и амигдалата, което предполага, че микроглиите имат роля в сексуалната диференциация на мозъка. 67, 68, 69 Въпреки че нашите експериментални условия разкриха намалена общителност както при мъжки, така и при женски мишки с микрофлия с дефицит на автофагия (Фигура 2 и допълнителна фигура 1), може да има разлики между мъжете и жените в тежестта или податливостта на аутистичното поведение и синапса разпоредби според контекста и околната среда, които трябва да бъдат разгледани в бъдеще.

Има голяма степен на вариации в начина, по който ASD засяга хората. По отношение на когнитивните функции, аутизмът може да съществува с всяко ниво на интелигентност. 70 Въпреки че интелектуалните увреждания често се придружават от ASD, делът на децата с ASD, които имат IQ над 70, се е увеличил. 71 По този начин ще бъде интересно да се разбере невробиологичната основа на разликата между ASD с ниски и високи когнитивни функции. Мишки с микрофлия с дефицит на автофагия показват ASD фенотипове като намалена общителност и повтарящо се поведение, но непокътната когнитивна функция като нормална социална новост (Фигура 2b). Тази характеристика може да е характеристика на вида ASD, причинен от микрофлия с дефицит на автофагия, което ще бъде интересна тема за разглеждане в бъдещи проучвания.

Различни изследвания на ЯМР разкриват отклонения в анатомичните и функционални връзки в мозъка на пациенти с ASD. 72, 73, 74 Дефектите в синаптичното подрязване от микроглия по време на развитието водят до намалена функционална свързаност между мозъчните региони и нарушено социално взаимодействие. 10 Също така забелязахме, че микроструктурната свързаност е променена и че функционалната свързаност е намалена в мозъка на Atg7 fl/fl; Lyz2-cre мишки в дифузионно тензорно изображение и анализ на fMRI, които могат да бъдат свързани със синаптични промени, причинени от микрофлия с дефицит на автофагия ( Допълнителна фигура S3). По този начин, автофагията в микроглията може да повлияе на функционалната свързаност между мозъчните региони, а увреждането на микроглиалната автофагия води до намалена функционална свързаност и ASD-подобно поведение.

В обобщение, нашите открития разкриват ролята на микроглиалната автофагия в синаптичното подрязване и узряване на невронни връзки по време на развитието и формирането на нормално социално поведение. Повишените дендритни бодли и незрелите филоподии в неврони с дефицит на автофагия микроглия могат да допринесат за патогенезата на ASD (допълнителна фигура S5). Следователно, регулирането на микроглиалната автофагия може да бъде стратегия за терапия и профилактика на ASD.

Препратки

King BH, Navot N, Bernier R, Webb SJ. Актуализация на диагностичната класификация при аутизъм. Curr Opin Психиатрия 2014; 27: 105–109.