Affiliation Food Nutrition & Health, AgResearch Grasslands, Palmerston North, Нова Зеландия

фекалния

Хранене и здраве на животните, AgResearch Grasslands, Palmerston North, Нова Зеландия

Affiliation Food Nutrition & Health, AgResearch Grasslands, Palmerston North, Нова Зеландия

Отдел за хранителни науки, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, Илинойс, Съединени американски щати

Отдел за хранителни науки, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, Илинойс, Съединени американски щати, Департамент по животински науки, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, Илинойс, Съединени американски щати

Принадлежности Хранене и здраве на храните, AgResearch Grasslands, Palmerston North, New Zealand, The Riddet Institute, Massey University, Palmerston North, New Zealand

Партньорски център по котешко хранене, Институт по храни, хранене и човешко здраве, Университет Massey, Палмерстън Север, Нова Зеландия

  • Ема Н. Бърмингам,
  • Сандра Кителман,
  • Уейн Йънг,
  • Катрин Р. Кер,
  • Кели С. Суонсън,
  • Никол К. Рой,
  • Дейвид Г. Томас

Фигури

Резюме

Ефектите на диетата преди (т.е. гестация и по време на кърмене) и диетата след отбиването върху състава на фекалните бактериални съобщества и мастната експресия на ключови гени в глюкозните и инсулиновите пътища са изследвани при котката. Куинс се поддържа на умерен протеин: мазнини: въглехидрати, разкъсани („Диета A“; 35: 20: 28% DM; n = 4) или високо съдържание на протеини: мазнини: въглехидратни консерви („Диета B“; 45: 37: 2% DM; n = 3) диета по време на бременност и кърмене. Потомците се отбиват от тези диети в вложен дизайн (n = 5 на лечение). Проби от фекалии са събрани на 8 и 17 седмична възраст. ДНК се изолира от фекалиите и бактериалните 16S rRNA генни ампликони се анализират чрез пиросеквениране. РНК се извлича от кръв (wk 18) и мастна тъкан и тъкани на яйчниците/тестисите (wk 24) и нива на генна експресия, определени с помощта на RT-qPCR. Разлики (P Таблица 1. Профил на макроелементите на търговско достъпна Асоциация на американските длъжностни лица за контрол на фуражите (AAFCO), тествани с фураж диети, хранени с домашни котенца с къса коса (Felis catus).

Животни и жилища. Осем дами (отгледани от 3 несвързани тома; средна възраст 5,3 ± 0,4 години) бяха разпределени на случаен принцип към една от двете диети (n = 4 на диета). Кралиците получават или диета А или диета В ad libitum по време на проучването (Таблица 1). Всяка кралица се чифтосваше с един несвързан мъж, хранен или с диета А, или с диета В. След потвърждаване на бременността (приблизително 7-8 седмици от бременността), маточниците бяха преместени в отделни, многопластови клетки за смилаемост, съдържащи гнездови кутии в горната част рафт [23]. Една седмица преди раждането, фекална проба се събира в рамките на 15 минути след дефекацията, бързо се замразява в течен азот и след това се съхранява при –85 ° C до анализ.

Общо двадесет котенца са родени и са претеглени в рамките на 24 часа (h) след раждането и през ден в продължение на 2 седмици (седмица) и след това на седмични интервали до края на проучването.

От седмица 0 до 4, всички котенца получават мляко изключително от язовира си. Половината от всяко кучило е разпределено на случаен принцип (в рамките на пола) върху диета А, а половината върху диета Б, образувайки четири групи за диетично лечение (A-A, A-B, B-B, B-A; Таблица 2). На 4 седмици на възраст котенцата се отбиват постепенно върху твърда храна, като получават както подходящата твърда храна, така и мляко до седмица 8, когато котенцата са напълно отбити. По време на процеса на отбиване (4 седмици нататък), котенцата са били настанявани групи според диетата след отбиване за хранене и социализация, връщайки се в язовира си само за достъп до мляко. На възраст 8 седмици котенцата се настаняват изключително според диетата им след отбиването. Диетата и водата са били налични ежедневно, за да се даде възможност за нормален растеж (Фигура 1).

Данните се отчитат като средни стойности ± SEM.

Диетата преди отбиване се определя като комбинирани ефекти от бременността и лактацията и ранното отбиване, а фазата след отбиването като точка, при която котето вече не получава мляко от майка си.

Фекално вземане на проби и подготовка на баркодирана амплификация на бактериални 16S рРНК гени и обединяване на ампликони. На възраст 8 и 17 седмици котенцата се настаняват поотделно в продължение на 24 часа и се събира прясна фекална проба в рамките на 15 минути след екскрецията, бързо замразява в течен азот и се съхранява при -85 ° C.

Експресия на тъканни гени. На 18 седмици на възраст се взема кръвна проба (0,5 ml) и РНК се екстрахира с помощта на Total RNA Minikit (Кръв/култивирани клетки) от Geneaid® (DNature, Gisborne, NZ) съгласно инструкциите на производителя. На 24 седмици, по време на кастрация, бяха взети проби от яйчникова тъкан (само за жени), тестикуларни тъкани (само за мъже) и коремни мастни тъкани (само за жени). Пробите от тъкани се измиват в ледено охладен физиологичен разтвор и след това се потапят в RNAlater® за една нощ, след което се съхраняват при –20 ° C до анализ. РНК беше извлечена от коремна мастна тъкан и репродуктивни тъкани с помощта на RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN Pty Ltd, VIC 3148, Австралия) съгласно инструкциите на производителя.

Експресия на синтаза на мастни киселини (FASN), транспортер на глюкоза 1 (GLUT1) и 4 (GLUT4), инсулинов рецептор (INSR), лептин (LEPT), хормоночувствителна липаза (LIPE), разединяващ протеин 2 (UCP2), инсулинов рецепторен субстрат 1 (IRS-1) и 2 (IRS-2), инхибитор на плазминогенен активатор-1 (PAI-1), пероксизомен пролиферативен активиран рецептор-γ (PPARG) бяха определени в проби от кръв и тъкани, използвайки RT-qPCR, както е описано по-горе [6], [14], [28], [29]. Накратко, общата РНК е била обратно транскрибирана, като се използват комплекти РНК-към-кДНК на Applied Biosystems с висок капацитет (Applied Biosystems Inc., Фостър Сити, Калифорния) и rt-qPCR върху термоциклер Rotor-Gene 6000 (Qiagen). Експресията на FASN, GLUT1, GLUT4, INSR, IRS1, IRS2, LEPT, LIPE, PAL-1, UCP2 и PPARG бяха нормализирани спрямо експресията на GAPDH.

Кривите на разреждане, базирани на индекса за разнообразие Chao1 (при 97% прекъсване на идентичността на последователността) показват, че фекалните бактериални съобщества на котки, хранени с диета A (---; n = 3 котки), са по-малко разнообразни от тези на котки, хранени с диета B ( -; n = 4 котки). Данните се отчитат като средни стойности ± SEM.

Влияние на диетата преди отбиване върху фекалните бактериални съобщества при котенца

Диетата преди отбиване не е повлияла на дела на фела във фекалиите на котенцата (Таблица 4), но пропорциите на някои таксони са променени (Таблица 5). Котенца от майки, хранени с диета А, показват повишено изобилие от Solobacterium, Peptococcaceae и Clostridiales и Clostridium (Таблица 5) и намалено изобилие от Megamonas и Allisonella (Таблица 5).

Влияние на диетичния формат след отбиване върху състава на фекалните бактериални общности на котенца

Няма ефект на възрастта за вземане на проби върху микробните популации (8 или 17 седмици, данните не са показани), поради което резултатите от тези два периода са обединени. При котенцата разнообразието на бактериалната популация е повлияно от диетата след отбиване (Фигура 3). Основният координатен анализ (PCoA) на претеглени и непретеглени филогенетични разстояния на Unifrac показа, че цялостната структура на микробиота в общността е най-сходна между поколенията, хранени с една и съща диета след отбиването, независимо от диетата на майката (Фигури 4 и 5). Многовариантният анализ показва, че диетата след отбиване има значителен ефект върху състава на общността (P Фигура 3. Ефектите от храненето преди и след отбиването на диета A или диета B върху микробното разнообразие на фекалиите при котенца (Felis catus).

Кривите на разреждане, базирани на индекса на разнообразие Chao1 (при 97% прекъсване на идентичността на последователността) показват, че фекалните бактериални съобщества на котенца, хранени с диета B (AB и BB; n = 10) са по-разнообразни от тези, хранени с диета A (AA и BA, n = 10). Диетата преди отбиване няма ефект върху разнообразието на общността в котето. Данните се отчитат като средни стойности ± SEM.

Процент вариации, уловени от всеки компонент, посочен по оси.

Процент вариации, уловени от всеки компонент, посочен по оси.

Цветът на клетката показва силата и посоката на корелация, като синьото представлява максималната отрицателна корелация, а червеното представлява максималната положителна корелация.

Дискусия

Ние предположихме, че диетата преди отбиване би повлияла значително на състава на фекалната микробиота на котето. Това проучване показва, че въпреки голямото разнообразие на фекалните микроби при бременни майки, диетата преди отбиване няма ефект върху състава на микробиотата на фекалиите при потомството, но нивата на генна експресия в кръвта и мастните тъкани са променени от диетата преди отбиването. Това предполага, че влиянието на майката върху генната експресия е дълготрайно, докато неговите ефекти върху микробните популации могат да бъдат относително краткосрочни въпреки относителната им стабилност през живота на индивида [7], [10].

Предишни проучвания върху гризачи показват, че диетата преди отбиване има ефект върху микробиотата на потомството, особено в ранния живот [21], [32]. Настоящото проучване, използващо секвениране от следващо поколение, идентифицира, че диетата преди отбиване има малко влияние върху състава на микробиотата в чревния тракт на котенцата, като диетите след отбиването имат основна роля за влиянието върху състава на фекалната микробиота. Това се доказва от големите разлики в разпределението на фила между бременните майки и техните потомци. В настоящото проучване периодът преди отбиването включва както бременност, така и лактация и преход на потомството от мляко към твърда храна. Следователно предварително отбитото потомство е било изложено на мляко от майка си, както и на диетата след отбиването. Бактериалният видов състав на млякото се определя, като се използват както зависими от културата, така и независими методологии (Cookson, непубликувани данни) и се предполага увеличаване на видовото разнообразие в млякото от котки, хранени с диета А. Въпреки това не видяхме много промени в чревния микробен състав, които бяха приписани към диетата преди отбиване. За разлика от тях, диетата след отбиване има голямо влияние върху фекалната микробиота на анализираните котенца.

Котета, хранени с диета След отбиване след увеличаване има изобилие от Firmicutes и Actinobacteria и намалено изобилие от Fusobacteria в сравнение с котенца, хранени с диета B след отбиване, в съответствие с резултатите, наблюдавани при възрастни котки, хранени с подобни диети [9] и кралиците в това проучване. По-голямата част от проучванията, изследващи микробите при здрави бозайници, идентифицират Firmicutes и Bacteroidetes като преобладаващи бактериални популации, присъстващи в чревните пътища. Нашето проучване потвърждава тези резултати. Въпреки това, преобладаващата фила, открита в това проучване, Firmicutes и Bacteroidetes, се различава от тези, наблюдавани по-рано [32], които съобщават Firmicutes и Actinobacteria като двете най-разпространени фили.

Актинобактериите показват намалено изобилие при котенца, хранени с диета В след отбиването. В актинобактериите са включени представители на рода Bifidobacterium и семейство Coriobacteriaceae. И двата таксона са свързани с подобрено здраве при модели на гризачи. Например, за бифидобактериите се смята, че подобряват здравето на червата [33], докато Coriobacteriaceae са свързани с намален кръвен глюкозен и холестеролен метаболизъм при гризачи [34], [35]. В настоящото проучване Collinsella е значително намалена при котенца, хранени с диета B. Намалената C. aerofaciens е свързана с диети с ниско съдържание на въглехидрати при хора [36]. Общият дял на актинобактериите в настоящото проучване (средно 0,6%) е много по-нисък от този, докладван по-рано за котенца (28,5%) [32] и възрастни котки (16%) [9], хранени с подобни диети. Бифидобактериите не са открити в нашето проучване, за разлика от предишно проучване, изследващо фекалния микробиом на котенца, хранени с високо протеинови (52% DM) диети [32]. Резултатите от настоящото ни проучване са в съгласие с по-ранно проучване от нашата лаборатория, използващо възрастни котки [9], но се различават от предишни проучвания [32], вероятно поради различия в аналитичните методологии (дизайн на праймера и т.н.).

Бактероидетите са свързани както с храносмилането на протеини, така и със СНО [37]. В настоящото проучване няма разлики в изобилието на членовете на Bacteroidetes, свързани с диетата; това се съгласува с резултатите при възрастни котки, хранени с подобни диети [9]. В рамките на Bacteroidetes изобилието на Bacteroides е по-високо при котенца, хранени с диета B след отбиване. В настоящото проучване изобилието на Bacteroides също е по-високо при котенца, хранени с диета B след отбиването. Това контрастира с резултатите при възрастни котки, които показват намаляване на Bacteroides, свързано с подобна диета [9]. Пропорциите на бактероидетите са по-високи в настоящото проучване (около 20%) в сравнение с това, наблюдавано по-рано при котенца, хранени с умерен или висок протеин: въглехидратни сухи диети (0,2% [32]).

Котенцата, хранени с диета B, са имали по-ниско изобилие от Firmicutes в сравнение с котенца, хранени с диета A. Изобилието от Firmicutes при котенца, хранени с диета A след отбиването, са подобни на тези, съобщени при котенца на същата възраст, хранени със сух, умерен протеин: CHO диета [32 ]. В рамките на вида Firmicutes са наблюдавани големи промени в изобилието на Lactobacillaceae (Lactobacillus), Veillonellaceae (Megasphaera), Peptostreptococcaceae (некласифицирани Peptostreptococcaceae) и Streptococcaceae (Streptococcus). Популациите на лактобацили са били по-високи при котенца, хранени с диета А, в сравнение с котенца, хранени с диета А. Подобно на [32], който наблюдава повишена Megasphaera, свързана с умерен протеин: CHO диета, Megasphaera spp. са били по-богати и на котенца, хранени с диета А в настоящото проучване. Възможно е увеличените пропорции на Megasphaera да се дължат на увеличаването на Lactobacillus spp. наблюдавани в настоящото проучване. За разлика от тях, пропорциите на Peptostreptococcaceae са по-високи при котенца на диета B, което е в съгласие с резултатите при възрастни котки [9].

Фузобактериите са протеолитични бактерии [38] и се наблюдават при ниски нива на здрави котки (0,3-5% от последователностите) [32], [39], [40]. Те са свързани с диети с високо съдържание на протеини при котенца [32], възрастни котки [9] и кучета [41]. В настоящото проучване изобилието от филотипове, принадлежащи към разред Fusobacterium, е по-високо при котенца, хранени с диета В спрямо диета А след отбиването (съответно 15 срещу 0,9%).

Като цяло пропорциите на протеобактериите не се различават между котенца, хранени с диета А или диета Б, само със Sutterella spp. увеличен при котенца, хранени с диета В след отбиването. Предишни изследвания показват повишени протеобактерии, свързани със суха, високо протеинова: въглехидратна диета при котенца [32] и мокра диета при възрастни котки [9]. Нивата на протеини в настоящото проучване са сходни (35% срещу 45% при диети А и В, съответно) на тези, хранени при възрастни котки (32–42%) [9].

В заключение това проучване установи, че докато диетата преди отбиване играе роля в промяната на нивата на експресия на гените, тя има малко влияние върху фекалните бактериални профили на потомството. За разлика от това, докато диетичният формат след отбиване няма ефект върху нивата на експресия на гените при потомството, той играе критична роля в бактериалния състав на фекалиите. Защо това може да е така, представлява интерес за бъдещи изследвания. Съществуват връзки между профилите на чревната микробиота и гените, участващи в пътищата на глюкозата и инсулина, и те могат да играят роля в дългосрочното здраве.

Благодарности

Авторите признават съдействието на г-жа Карин Уайдграф и г-жа Маргрет Хекман (и двете Университета на Маси) и г-н Брус Синклер (AgResearch) по време на това проучване.

Принос на автора

Замислени и проектирани експерименти: ENB NCR DGT. Изпълнява експериментите: ENB DGT. Анализирани данни: WY SK KRK. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: WY SK KSS. Написа хартията: ENB WY SK KRK NCR KSS DGT. Получено финансиране и проектирано и проведено проучване върху животни: ENB NCR DGT. Проектиран и проведен лабораторният компонент на изследването: ENB WY SK KRK.