Migyeong Jeong

1 Изследователски център за превенция на рака на CHA, Институт за рак на CHA, Университет на CHA, Сеул, Корея

Парк Джонг-Мин

1 Изследователски център за превенция на рака на CHA, Институт за рак на CHA, Университет на CHA, Сеул, Корея

Йънг-Мин Хан

1 Изследователски център за превенция на рака на CHA, Институт за рак на CHA, Университет на CHA, Сеул, Корея

Кун Йънг Парк

2 Колеж по хранене, Национален университет в Пусан, Пусан, Корея

Дон Хенг Лий

3 Катедра по гастроентерология, Медицински факултет, Университет Инха, Инчхън, Корея

Joon-Hwan Yoo

4 Център за храносмилателни заболявания, Медицински център CHA University Bundang, Seongnam, Корея

Joo Young Cho

4 Център за храносмилателни заболявания, Медицински център CHA University Bundang, Seongnam, Корея

Ки-Байк Хам

1 Изследователски център за превенция на рака на CHA, Институт за рак на CHA, Университет на CHA, Сеул, Корея

4 Център за храносмилателни заболявания, Медицински център CHA University Bundang, Seongnam, Корея

Свързани данни

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Инфекцията с хеликобактер пилори (H. pylori) се счита за основен рисков фактор за рак на стомаха, клас I канцероген, но не обяснява цялостната картина на стомашната канцерогенеза, тъй като допълнителни модификации като екологични или генетични фактори, тютюнопушене, алкохол, диета, хигиената и бактериалният или генетичният фон на гостоприемника също са замесени в канцерогенезата. Няма ясни доказателства в подкрепа на превенцията на рака само чрез ликвидиране на H. pylori [1], въпреки че инфекцията с H. pylori е важен рисков фактор за рак на стомаха. Диетичната модификация за инхибиране на канцерогенни пътища може да бъде практична стратегия за профилактика на рак на стомаха в допълнение към ликвидирането [2]. При стомашната канцерогенеза обаче самите диетични фактори са мечове с две остриета, замесени в канцерогенезата, но евентуално превантивни за други. Например, доказано е, че приемането на червено и преработено месо е свързано с повишен риск от рак на стомаха без кардия, докато зеленчуците и плодовете са защитни фактори, особено при позитивните антитела срещу H. pylori [3]. Въпреки че кохортните доказателства все още липсват, има няколко диетични подхода с антиоксиданти или нутрицевтици за предотвратяване на стомашни заболявания, свързани с H. pylori досега.

Като диетична интервенция за инфекция с H. pylori, ние изобретихме нова рецепта за предотвратяване на рак на кимчи (cpKimchi) и поставихме хипотезата, че диетичната намеса на нашия cpKimchi може да предотврати рак на стомаха, свързан с H. pylori при мишки. Генерирането на cpKimchi се основава на добавянето на синапен лист, круша, гъби, китайски пипер и сок от морски заплитания към стандартизирана рецепта за кимчи (вж. Допълнителна таблица 1), което беше избрано от нашето предварително проучване.

РЕЗУЛТАТИ

Различни биологични действия на sKimchi и cpKimchi в инфектиран с H. pylori клетъчен модел

стомаха

A. Клетъчна преживяемост чрез MTT анализ MTT анализ беше направен в AGS клетки (вляво) и RGM-1 клетки (вдясно) под предизвикателството с 1, 2,5, 5 и 7,5 mg/ml концентрация на sKimchi и cpKimchi разтворими екстракти, съответно. Отбелязани са значителни цитотоксичности при кимчи концентрация над 5 mg/ml само в AGS клетки, нито в RGM-1 клетки дори след кимчи повече от 5 mg/ml Б. Уестърн блот на HO-1 след всеки екстракт от кимчи ° С. Уестърн петно ​​за Bax и разцепена каспаза-3 д. Анализ на зарастване на рани в AGS клетки Предишно проучване показва, че cpKimchi дава селективна цитотоксичност в раковите клетки, анализ на зарастване на рани след прилагане на всеки екстракт от кимчи в AGS клетки. Значително забавяне на зарастването на рани е отбелязано в група, прилагана с екстракти от cpKimchi. Е. RT-PCR и Western blot за COX-2, IL-8 и TNF-α в присъствието на инфекция с H. pylori (MOI = 10). cpKimchi значително намалява експресията на COX-2 и TNF-α, индуцирана от H. pylori.

Подобряване на ефикасността и механизмите на cpKimchi при хроничен атрофичен гастрит, заразен с H. pylori

Отслабен хроничен гастрит с 24-седмичен хранителен прием на cpKimchi

A. Промени на COX-2 и възпалителни медиатори според група На Western blot и RT-PCR анализ на експресията на COX-2 на лигавицата, COX-2 е значително увеличен след инфекция с H. pylori, но неговата експресия е значително намалена в група, лекувана с cpKimchi. RT-PCR за IL-1β, VEGF, IL-6, MMP-2 е показан според групата и cpKimchi значително намалява тези медииращи възпаление, индуцирани от H. pylori. Б. Имунохистохимичните промени в експресиите на COX-2 и инфилтрациите в макрофаги според експресиите на група COX-2 и F/80 са значително увеличени в контролната група, заразена с H. pylori. Въпреки това, хроничният 36 седмичен прием на cpKimchi в питейна вода значително намалява експресията на COX-2, както и инфилтрацията на макрофаги (р 9 единици, образуващи колонии (CFU))/ml. Във всички експерименти са използвани култури, отглеждани за 72 часа на TS агарови плочи.

Модел на заразени с H. pylori мишки

Животни

Брутен индекс

След убиването на животните изолираните стомаси се разрязват по протежение на по-голямата кривина и се измиват с ледено-физиологичен разтвор. За да се изследва степента на грубо увреждане на лигавицата, мукозните страни на стомаха се снимат с цифров фотоапарат и част от лигавицата веднага се фиксира с 10% разтвор на формалин. Грубите увреждания на стомашната лигавица бяха оценени от трима гастроентеролози, които бяха заслепени за лечението, използвайки брутен индекс на язва [33]. Тези видове лезии бяха дефинирани както следва; тип I, наличие на оток, хиперемия или единичен субмукозен точков кръвоизлив; тип II, наличие на субмукозни хеморагични лезии с малки ерозии; тип III, наличие на дълбока язва с ерозии и инвазивни лезии.

Хистопатология

За хистопатологичен анализ стомахът се фиксира в 10% неутрализиран буфериран формалин, обработва се по стандартния метод и се влага в парафин. След това участъци с дебелина 4 μm бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) [34]. Хистологично се изследват жлезистите лигавици на корпуса и антрала. Патологичните промени на инфекцията с H. pylori, като инфилтрация на възпалителни клетки, ерозивни лезии, улцерация, дисплазия, образуване на аденом (предракова лезия), бяха оценени от трима гастроентеролози, които бяха заслепени за лечението, използвайки дефиниран индекс на хистологично увреждане [35]. В това проучване възпалението се определя като степен на инфилтрация на възпалителни клетки, 0: няма, 1: под ламина проприа, 2: половината от лигавицата 3: до слоя на епителната жлеза (всички лигавици). Ерозията се определя като пропорция от ерозивна лезия, 0: няма, 1: загуба на слой на епителната жлеза (1/3 пропорция), 2: две-три порции лигавица (2/3 пропорция) 3: цялата лигавица (3/3 пропорция) (допълнителна таблица 2)

Western blot анализ

Екстрахираните стомашни тъкани се промиват два пъти с PBS и след това се лизират в буфер за лизис на студено клетъчен лизис (Cell Signaling Technology, Denver, MA), съдържащ 1 mM фенилметилсулфонил флуорид (PMSF, Sigma Aldrich, St Louis, MO). След 20 минути инкубация, пробите се центрофугират при 10 000 × g за 10 минути. След това бяха събрани супернатанти. Протеините в лизатите се разделят чрез електрофореза на полиакриламиден гел на натриев додецил сулфат (SDS-PAGE) и се прехвърлят в мембраните на поливинилиден флуорид (PVDF), които се инкубират с първични антитела, промиват се, инкубират се с конюгирани с пероксидаза вторични антитела, премиват се и след това се визуализират подобрена система за хемилуминесценция (ECL) (GE Healthcare, Бъкингамшир, Великобритания).

Имунохистохимично оцветяване

След като парафиновите блокове бяха обезпарафинирани и рехидратирани със сортиран алкохол, тъканните секции бяха загряти в бурканчета под налягане, пълни с 10 тМ цитратен буфер в микровълнова печка в продължение на 10 минути. Слайдовете бяха охладени във вода за 15 минути и измити в PBS. Слайдовете бяха инкубирани за една нощ с първичното антитяло. След инкубация се формира последваща реакция, като се използва комплект VECTOR (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA). Накрая предметните стъкла се инкубират с 3, 3ȃ-2-диаминобензидин (Invitrogen Life Technologies) и се оцветяват с хематоксилин (Sigma-Aldrich). Броят на антитяло положителните клетки беше определен в 5 полета на субмезотелиалната област, избрани на случаен принцип във всяка мишка и изследвани при увеличение от 100 пъти. Стойностите са дадени като средни стойности ± S.E.M.

PAS оцветяване

За оцветяването с периодична киселина и Schiff се извършва хистохимично оцветяване на гликоконюгати по метода на Pandurangan [36], като се използва 2% периодична киселина и реагент на Schiff (PAS) на тъмно в продължение на 20 минути. Това доведе до резултат на PAS оцветяване между 10 (отлично запазване) и 0 (лошо съхранение).

TUNEL анализ

За да се открие апоптоза, стомашните тъкани се оцветяват с терминирания дезоксинуклеотидил трансфераза-медииран dUTP nick-end метод за маркиране (TUNEL), използвайки системата DeadEnd ™ Fluorometric TUNEL (G3250 #, Promega, USA).

In vitro инфектиран с H. pylori клетъчен модел

Анализ на клетъчна култура и цитотоксичност

Стомашни епителни клетъчни линии на плъхове (RGM-1) са дадени от проф. H. Matsui (Tsukuba Univ., Япония) и AGS клетки са закупени от ATCC (Manassas, VA), където клетките са правилно съхранявани и рутинно удостоверявани (включително ДНК пръстови отпечатъци). След реанимация в нашата лаборатория всички клетки бяха използвани не повече от 6 месеца. AGS клетките се култивират в среда RPMI-1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), а клетките RGM-1 се култивират в среда DMEM. Всички среди, допълнени с 10% фетален говежди серум (Gibco BRL) при 37 ° C в 5% CO2. Клетъчната жизнеспособност беше оценена с помощта на МТТ колориметричен анализ. МТТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид] е закупен от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, МО). Филтратът (50 g) се смесва с 1 L вода и след това се лиофилизира. Клетките се поставят в 96-ямкови плаки при 104 клетки/ml и се оставят да залепнат за 24 часа. Екстрактът Kimchi се прилага в пробните ямки при различни концентрации за 24 h.

Клетъчната миграция се наблюдава с изображение на жива клетка

AGS клетките, третирани с дозозависими sKimchi и cpKimchi, бяха ранени с връх на пипета и наблюдавани под ScopeTek MDC200 (CHA University, Сеул, Корея), в които растежът на клетките се наблюдаваше до 18 часа и се записваше с интервал от 3 минути. Бяха наблюдавани три различни групи; Няма лечение, дозозависимо лечение на sKimchi и лечение на cpKimchi. С неподвижната снимка, направена след 18 часа, средната скорост на клетъчен растеж се изчислява според групата и се показват средните нива на миграция на клетките.

ELISA анализ

След събиране на стомаха и се хомогенизира в 10 mM натриев фосфатен буфер, рН 7,4 (1 ml). След центрофугиране (9000 х g), нивото на PGE2 в супернатанта се измерва с ELISA и концентрацията се изразява като pg/mg протеин. Процесите са извършени съгласно ръкописа на комплекта за EIA за простагландин E2 Express (Cayman, Ann Arbor, MI).

Уестърн блот за HO-1, Bax, PARP и разцепена капсаза-3

Екстрахираните клетки се промиват два пъти с PBS и след това се лизират в ледено буфер за лизис на клетъчни клетки (Cell Signaling Technology, Denver, МА), съдържащ 1 mM фенилметилсулфонил флуорид (PMSF, Sigma Aldrich, St Louis, MO). След 20 минути инкубация, пробите се центрофугират при 10 000 × g за 10 минути. След това бяха събрани супернатанти. Протеините в лизатите се разделят чрез електрофореза на полиакриламиден гел на натриев додецил сулфат (SDS-PAGE) и се прехвърлят в мембраните на поливинилиден флуорид (PVDF), които се инкубират с първични антитела, промиват се, инкубират се с конюгирани с пероксидаза вторични антитела, премиват се и след това се визуализират подобрена система за хемилуминесценция (ECL) (GE Healthcare, Бъкингамшир, Великобритания).

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средна стойност (стандартно отклонение (SD). Статистически анализи са проведени с GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) и SPSS софтуер (версия 12.0; SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Статистически значимостта между групите се определя чрез тест на Mann-Whitney U. Статистическата значимост е приета при p (1.4M, pdf)

Благодарности

Благодарим на д-р Ън-Хи Ким за техническа помощ.

Бележки под линия

ФИНАНСОВА ПОДКРЕПА

Това изследване беше подкрепено от безвъзмездните средства от Корейския институт за развитие на индустрията на здравеопазването (KHIDI), а също и от Националния център за оценка на ефикасността за разработване на здравни продукти, насочени към храносмилателни разстройства (NCEED) и подкрепено от безвъзмездни средства от програмата за научноизследователска и развойна дейност на Глобализацията на корейските храни от Министерството на храните, земеделието, горите и рибарството, Република Корея.