Д-р Йонг Уон Юн и д-р Мьонг-Сук Чой,

бяла

Катедра по биотехнологии, Университет Тегу, Кюнгсан, Кюнгбук 712-714

(Република Корея); и Център за изследване на храните и хранителната геномика,

Департамент по хранителни науки и хранене, Национален университет Kyungpook, Daegu

702-701 (Република Корея); Имейл [email protected], Имейл [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Затлъстяването е мултифакторно разстройство, което се влияе както от генетични, така и от фактори на околната среда, което води до физически и външни усложнения, както и до прогресиране на различни заболявания като сърдечно-съдови рискове, хипертония, дислипидемия, ендотелна дисфункция и захарен диабет тип 2 [1,2, 3].

Възприемчивостта към наддаване на тегло може да варира значително сред индивидите поради външни влияния като прекомерен прием на енергия и ниска физическа активност [4,5,6]. Съществуват обаче големи междуличностни разлики в развитието на затлъстяването, въпреки излагането на подобни условия. Например, някои могат лесно да наддават на телесно тегло и да затлъстяват (склонна към затлъстяване, OP), докато други може да не (устойчиви на затлъстяване, ИЛИ) [7]. Въпреки това пътищата, отговорни за тези фенотипни различия, все още са до голяма степен неизвестни [8].

В днешно време превенцията и управлението на затлъстяването са основни предизвикателства за общественото здраве и вече не се считат само за козметични проблеми. Въпреки че лекарствата за отслабване и контрол на теглото са често срещани, техните медицински ефекти далеч не са задоволителни, тъй като много фармацевтични продукти имат нежелани странични ефекти [9]. Поради опасения относно наличните в момента лечения от западната медицина, някои се обърнаха към интереса си към алтернативни лекарства, включително традиционната ориенталска медицина, за терапевтично лечение на затлъстяването [10,11,12].

За да се открият маркерни молекули, които биха могли да помогнат за изясняване на механизмите, залегнали в чувствителността към затлъстяване, са изследвани различни животински тъкани и са анализирани целите им протеоми, за да се характеризират белтъчните функции и пост-транслационните модификации [24,25]. Разделянето, идентифицирането и характеризирането на протеините, както и взаимодействието им с други протеини са основните цели на протеомния анализ. Двумерната електрофореза (2-DE), съчетана с MALDI-TOF-MS, се счита за мощен инструмент за разделяне на хиляди протеини от мастна тъкан [26,27]. Този подход дава възможност за сравнение между нормални и болестни проби, разкриващи диференцирано експресирани протеини.

Свързаните със затлъстяването фактори в протеините на мастната тъкан играят основна роля в развитието на метаболитни нарушения [26,28]. Мастната тъкан действа като активен ендокринен орган, който отделя адипокини, допринасяйки за регулирането на физиологичните процеси като енергийна хомеостаза, възпроизводство и възпаление. Няколко проучвания, базирани на генно профилиране, са фокусирани върху препрограмирането на WAT след загуба на тегло [29,30]. Въпреки че ДНК масивът е мощен инструмент за тази цел, прогнозната стойност на експресията на иРНК е ограничена по отношение на клетъчната физиология. Нивата на експресия на иРНК често не са успоредни с нивата на експресия на протеин на определен ген [31,32]. Освен това, обменът на протеини и пост-транслационните модификации, които са от съществено значение за клетъчното поведение, не са обхванати от информацията, получена от ДНК данни [33]. Следователно, по-широкото разбиране на ефектите от диетата върху WAT изисква независимо изследване на експресията и функцията на протеини във връзка с анализи на експресия на иРНК.

В настоящото проучване разгледахме ефектите срещу затлъстяването на естествените традиционни билкови лекарства въз основа на техните способности да променят експресията на WAT протеини при HFD-индуцирани затлъстели мишки. Доколкото ни е известно, това е първото изследване на протеомиката, профилиращо модулирането на WAT протеин от традиционни билкови лекарства в модел на затлъстели животни.

Материали и методи

Животни и условия за разплод

маса 1

Диетични състави с нормална диета (ND), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и диета с високо съдържание на мазнини с Taeumjowi-tang (TH)

Приготвяне на протеинови проби

WAT се изрязват от мишки веднага след анестезиране с диетилов етер след гладно през нощта. След това получените тъкани се измиват със студен физиологичен разтвор и се пулверизират под течен азот и се съхраняват при -80 ° С. Тъканите се лизират в 200 ml рехидратиращ буферен разтвор, съдържащ 7 M урея, 2 M тиокарбамид, 4% CHAPS, 20 mM DTT, 1 mM PMSF, 2% IPG буфер (Ampholyte 3/10, Bio-Rad) и следи от бромофенол син. След това лизираните тъкани се хомогенизират чрез хомогенизатор (PT 1200E, Kinematica, Luzern, Швейцария) върху лед, след което екстракти от хомогенизирани WAT тъкани се центрофугират 13 000 ×ж за 20 минути. След това супернатантата се съхранява при -80 ° С до анализ. Съдържанието на протеин в цялата WAT тъкан се определя с помощта на RC DC ™ протеинов анализ (Bio-Rad).

Двумерна електрофореза (2-DE)

Придобиване на изображения и анализ на данни

Геловете са изобразени на UMAX PowerLook 1120 (Maxium Technologies, Akron, OH, USA), а за сравнение на изображения е използван модифициран 2-D софтуер ImageMaster V4.95 (GE Healthcare). Референтен гел беше избран от гелове от нормалната група и откритите петна от други гелове бяха съчетани с тези в референтния гел. Относителната оптична плътност и относителният обем бяха изчислени, за да се коригират разликите в оцветяването с гел. Всеки обем на интензитета на петна се обработва чрез изваждане на фона и нормализиране на общия обем на спота и полученият процент на обема на петна се използва за сравнение.

Идентификация на протеини

За идентифициране на протеини чрез PMF, протеиновите петна се изрязват, смилат се с трипсин (Promega, Madison, WI, USA), смесват се с CHCA в 50% ACN/0,1% TFA и се подлагат на MALDI-TOF анализ (Microflex LRF 20, Bruker Daltonics ). Спектрите бяха събрани от 300 снимки на спектър в m/z диапазон от 600-3000 и калибрирани чрез двуточково вътрешно калибриране, използвайки трипсинови пикове за автоматично смилане (m/z 842.5099, 2211.1046). Списъкът с пикове е генериран с помощта на Flex Analysis (версия 3.0). Използваният праг за избор на пикове беше както следва: 500 за минимална разделителна способност на моноизотопната маса, 5,0 за S/N. Пептидните маси се съчетават с теоретичните пептиди на всички протеини в базата данни NCBI, използвайки MASCOT, разработена от Matrixscience (http://www.matrixscience.com). За търсене в базата данни бяха използвани следните параметри: трипсин като разцепващ ензим, максимум едно пропуснато разцепване, йодоацетамид (Cys) като цялостна модификация, окисление (Met) като частична модификация, моноизотопни маси и толеранс на маса от ± 0,1 Da. Резултатът от протеини е -10 * Log (стр), където стр е вероятността наблюдаваното съвпадение да е случайно събитие и по-голямо от 61 е значително (стр а F, последователност от сетивни нишки; б R, последователност от антисенс направления

Статистически анализ

Всички експериментални резултати бяха сравнени чрез еднопосочен вариационен анализ (ANOVA), използвайки програмата Статистически пакет за социални науки (SPSS, версия 14.0k); данните са изразени като средната стойност ± SEM. Тест за защитена най-малко значима разлика (LSD), който е метод за многократно сравнение, състоящ се от едноетапни процедури в еднопосочен ANOVA, е използван за демонстриране на значителни разлики между средните стойности (стр номер за присъединяване към база данни на NCBInr/SWISS. b Номиналната маса е целочислената маса на най-разпространения в природата стабилен изотоп на елемент. c MASCOT базиран на вероятността резултат за търсене на молекулно тегло, изчислен за PMF. Резултатът от протеини е - 10 x log (P), където P е вероятността наблюдаваното съвпадение да е случайно събитие; тя се основава на базата данни NCBInr, използваща програмата за търсене MASCOT, тъй като данните за MS/MS и протеините> 61 са значителни (P d ND означава, че не е открит. Spot Id е същите числа в изображението на гел от фиг. 2

Фиг. 2

Представителни оцветени в сребро 2-DE гел изображения на мишки WAT протеоми. (A) Регулирани нагоре и (B) регулирани надолу протеини при OP мишки в сравнение с ND-хранени мишки. Диференциално регулираните протеини и протеините, които представляват интерес, са маркирани с кръгове и стрелки. Номерата в геловете са изброени в таблица 3.

Диференциална експресия на свързани със затлъстяването протеини в WAT

Преди да сравним диференциално променените протеини между OP и OR мишки, първо сравнихме нивата на WAT протеин сред ND, OP и OR мишки. Повечето от идентифицираните протеини показват значително променена протеинова експресия между OP и ND-хранени мишки в отговор на лечение с TH, докато 45 протеини показват сходни нива в OR мишки (Фиг. 3). Общо 26 протеина бяха регулирани нагоре при OP мишки, като същевременно се поддържаха на ниски нива при ND и OR мишки. Освен това, анализ на проби от WAT идентифицира 31 протеини, които бяха регулирани надолу в HFD-хранени OP мишки, но регулирани нагоре при нормални и OR мишки. Досега повечето от тези протеини не са показани като диференцирано експресирани в WAT в отговор на HFD. Следователно, тези протеини могат да се разглеждат като потенциални маркерни протеини за определяне на фенотипни разлики в WAT между OP и OR мишки.

Фиг. 3

Диференциално регулирани протеини в WAT от OP мишки в сравнение с ND/OR/TH мишки. (A) Регулирани нагоре и (B) регулирани надолу протеини при OP мишки. Всяка лента показва средна обемна плътност (%) при 2-DE анализ. Статистическата значимост между ND и OP беше определена чрез еднопосочен ANOVA тест, където стр