Резюме

ОБЕКТИВЕН Натрупването на доказателства показва, че чревната микробиота е важен модификатор на затлъстяването и диабета. Засега обаче няма информация за чревната микробиота и „живите чревни бактерии“ в системното кръвообращение на японски пациенти с диабет тип 2.

червата

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА Използвайки метод на чувствителна обратна транскрипция-количествена PCR (RT-qPCR), ние определихме състава на микробиотата на фекалните черва при 50 японски пациенти с диабет тип 2 и 50 контролни субекта и връзката му с различни клинични параметри, включително възпалителни маркери. Също така анализирахме наличието на чревни бактерии в кръвни проби.

РЕЗУЛТАТИ Броят на групата Clostridium coccoides, Atopobium cluster и Prevotella (облигатни анаероби) е значително по-нисък (P 100 IU/L) или сериозно бъбречно заболяване (ниво на серумен креатинин> 2.0 mg/dL; 4) остра сърдечна недостатъчност; 5) злокачествено заболяване; 6) възпалително заболяване на червата; и 7) анамнеза за лечение с антибиотици в рамките на 3 месеца след участие в проучването. Протоколът за изследването е одобрен от Комитета по човешка етика на университета Juntendo и е получено писмено информирано съгласие от всеки пациент преди записване в проучването.

Определяне на броя на бактериите чрез 16S rRNA-целенасочена обратна транскрипция – количествена PCR

След записването в проучването, участниците бяха помолени да представят пресни фекални проби. Фекалните проби бяха поставени директно в две епруветки (∼1,0 g/епруветка) от участниците или членовете на болничния персонал; едната епруветка съдържа 2 ml RNAlater (разтвор за стабилизиране на РНК; Ambion, Austin, TX), а другата е празна. Пробите се поставят в хладилник при 4 ° C (за анализ на фекална микробиота) или във фризер при -20 ° C (за анализ на концентрацията на органична киселина във фекалиите и pH на фекалиите) в рамките на 30 минути след екскрецията. Кръвни проби бяха получени след бързо нощуване, в рамките на 5 дни след подаване на фекални проби. Един милилитър кръв се добавя към 2 ml RNAprotect бактериален реагент (Qiagen, Hilden, Германия) веднага след събирането. Пробите се съхраняват при -80 ° C. Както фекалните, така и кръвните проби бяха транспортирани при -20 ° C до Централния институт за микробиологични изследвания в Якулт.

За количествено определяне на бактериите, присъстващи в пробите, ние извличаме общите фракции на РНК от изпражненията и кръвта по метода, описан по-рано (18–21), и изследвахме чревния микробиотен състав и плазмените нива на чревните бактерии, използвайки 16S rRNA-насочена RT –Количествена PCR (qPCR), използваща чревната флора на Yakult-SCAN. Три серийни разреждания на екстрахираната РНК проба бяха използвани за бактериална rRNA-насочена RT-qPCR (18–21), а праговите стойности на цикъла в линейния диапазон на анализа бяха приложени към стандартната крива, за да се получи съответният брой на бактериалните клетки в всяка проба от нуклеинова киселина. След това тези данни бяха използвани за определяне на броя на бактериите на проба. Специфичността на RT-qPCR анализа, използвайки групови, родови или видови специфични праймери, се определя, както е описано по-горе (18–21). Последователностите на праймерите са изброени в допълнителна таблица 1.

Измерване на органични киселини и pH

Концентрациите на органични киселини във фекалиите и серума бяха определени с помощта на методи, описани по-рано (21) с леки модификации. Накратко, замразената проба се хомогенизира в четири обема 0,15 mol/L перхлорна киселина и се оставя да престои при 4 ° С в продължение на 12 часа. Суспензията се центрофугира при 20 400 х g при 4 ° С в продължение на 10 минути. След това получената супернатанта се пропуска през филтър с размер на порите 0,45 μm (Millipore Japan, Tokyo, Japan). Пробата беше анализирана за органични киселини с помощта на високоефективна система за течна хроматография (432 детектор за проводимост; Waters Co., Milford, MA) и рН във фекалиите беше анализиран с помощта на IQ 150 pH/термометър (IQ Scientific Instruments, Inc., Карлсбад, Калифорния).

Биохимични анализи

Кръвни проби бяха получени след бърза нощ. Серумните липиди (общ холестерол [T-CHO], HDL холестерол [HDL-C], LDL холестерол и триглицериди [TG]), кръвната глюкоза на гладно и HbA1c се измерват със стандартни техники. Плазмените нива на високочувствителен С-реактивен протеин (hs-CRP), интерлевкин-6 (IL-6) и фактор на туморна некроза (TNF) -α са измерени чрез латексна нефелометрия, хемилуминесцентен ензимен анализ и ELISA в частен лаборатория (SRL Laboratory, Токио, Япония), съответно. Плазменото ниво на LPS свързващ протеин (LBP) е измерено с човешки LBP ELISA комплект (Hycult Biotech, Холандия).

Въпросник за приема на диети

Оригиналният самоуправляващ се въпросник за историята на диетата (DHQ) е разработен от Sasaki et al. (22) през 1998 г. и валидността му е потвърдена. Отговорът обаче отнема ∼45–60 минути. В това проучване ние приехме самоконтролиран DHQ от кратък тип (BDHQ) (23), тъй като BDHQ отнема само ~ 15–20 минути, за да отговори. Валидността на BDHQ също се потвърждава, както е описано по-горе (23). Въпросникът беше попълнен, когато участниците посетиха болницата, за да предоставят кръвни проби. Това е структуриран, самостоятелно администриран въпросник с четири страници, който оценява хранителните навици през предходния месец. Повечето храни и напитки са избрани от списък с храни, които се консумират много често в Япония, като се използва списък с храни, който с някои модификации е използван в Националното проучване на здравето и храненето на Япония. В допълнение към BDHQ, участниците предоставиха допълнителна писмена информация за честотата на консумация на специфични храни, за които е известно, че влияят на чревната микробиота като кисело мляко и хранителни добавки.

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха проведени с помощта на статистическия софтуерен пакет JMP, версия 10.0.2 (SAS Institute, Cary, NC). Данните бяха изразени като средна стойност ± SD за нормално разпределени данни и медиана (интерквартилен диапазон) за данни с изкривено разпределение. Тестът Mann-Whitney U е използван за анализ на данните. Използва се корелационен анализ на Spearman, за да се определи връзката между броя на фекалните бактерии/органични киселини, LBP и клиничните параметри. Степента на откриване беше анализирана с помощта на директен тест за вероятност на Fisher. P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Характеристика на учебните предмети

Очакваният общ енергиен прием според въпросника BDHQ е бил 1,662 ± 569 и 1,749 ± 521 kcal/ден, съответно в групата с диабет тип 2 и контролната група. Съотношението на приема на въглехидрати към общия енергиен прием е 56,1 ± 7,9% в групата с диабет и 53,9 ± 6,6% в контролната група, докато съотношението на приема на мазнини е съответно 26,8 ± 5,7% и 28,6 ± 5,1% и съотношението прием на протеин е съответно 17,1 ± 3,5% и 17,5 ± 3,0%. Няма значителни разлики в приема на обща енергия, въглехидрати, мазнини и протеини между двете групи. Броят на участниците, поглъщащи кисело мляко поне веднъж седмично, е сходен в двете групи (участници в група 32 на диабет; участници в контролна група 30).

Броят на фекалните бактерии не се различава значително между двете групи (Таблица 2). Въпреки това, сред задължителния анаероб, броят на групата Clostridium coccoides, Atopobium cluster и Prevotella е значително по-нисък (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Сравнения на броя на бактериите, органичните киселини и рН между контролните субекти и пациентите с диабет тип 2

Известно е, че инхибиторите на метформин и α-глюкозидаза засягат стомашно-чревната система. По този начин ние изследвахме разликата в чревната микробиота между пациенти с диабет със и без метформин и инхибитори на α-глюкозидазата. Нивата на Enterobacteriaceae (7,5 ± 0,9 [n = 18] спрямо 6,7 ± 1,1 log10 клетки/g [n = 31], P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Корелации между броя на фекалните бактерии, органичните киселини и различните клинични параметри при пациенти с диабет тип 2

Таблица 3 също така обобщава връзките между различни клинични параметри, хранителни продукти, изброени в BDHQ, и фекални органични киселини, променени при пациенти с диабет тип 2. Общите фекални органични киселини корелират отрицателно с приема на наситени мастни киселини (r = -0,325) и общия прием на мазнини (r = -0,324) и положително с приема на въглехидрати (r = 0,281) при пациенти с диабет тип 2. Нивото на фецетна оцетна киселина корелира отрицателно с приема на наситени мастни киселини (r = -0,364), общия прием на мазнини (r = -0,327) и продължителността на диабета (r = -0,301) и положително с приема на въглехидрати (r = 0,356). Подобно на оцетната киселина, фекалното ниво на пропионовата киселина корелира отрицателно с продължителността на диабета (r = -0,349) и приема на наситени мастни киселини (r = -0,311). Високите фекални нива на изовалерианова киселина при пациенти с диабет тип 2 не корелират с клиничните параметри или хранителните продукти, изброени в BDHQ.

Таблица 4 показва скоростта на откриване на рРНК на чревни бактерии в кръвни проби. Бактериите са открити при 14 от 50 субекта в групата с диабет, в сравнение само с 2 от 50 субекта в контролната група (28% срещу 4%, P (r = 0,313, P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Брой бактерии в кръвни проби и нива на LBP

Заключения

Основните констатации от настоящото проучване са чревна дисбиоза и наличие на живи бактерии в кръвта на японски пациенти с диабет тип 2. Amar et al. (17) съобщава по-рано, че кръвната концентрация на бактериални гени (използвайки бактериална 16S рДНК) може да предскаже появата на диабет, което показва за първи път клиничното значение на кръвната микробиота в развитието на диабет тип 2. Анализът на бактериалната 16S рДНК обаче не може да различи дали насочените бактерии в червата и кръвта са живи или мъртви. Поради тази причина в настоящото проучване използвахме RT-qPCR, който може да открие живи бактерии както в червата, така и в кръвта, тъй като този метод използва специфични праймери, насочени към бактериални РНК молекули (18). Използвайки тази технология, ние идентифицирахме наличието на чревна дисбиоза и възможната бактериална транслокация от червата в кръв при японски пациенти с диабет тип 2.

Сложните въглехидрати, като диетични фибри, се метаболизират от микробиотата на дебелото черво в олигозахариди и монозахариди и се ферментират до мастни киселини с къса верига, като маслена киселина, оцетна киселина и пропионова киселина (2). Маслена киселина осигурява енергия за епителните клетки на дебелото черво (27). Освен това се съобщава, че късоверижните мастни киселини стимулират секрецията на GLP-1 чрез G-протеин-свързан рецептор (FFAR2) (28). По този начин органичните киселини, произведени от чревната флора, са тясно свързани с добива на енергия от храната и хомеостазата на глюкозата от инкретиновия хормон. Интересното е, че в нашето проучване фекалните концентрации на обща органична киселина, оцетна киселина и пропионова киселина при пациенти с диабет тип 2 са значително по-ниски от тези при контролните субекти, а фекалните концентрации на оцетна киселина и пропионова киселина корелират отрицателно с продължителност на диабета. Освен това органичните киселини във фекалиите спомагат за елиминирането на Escherichia coli O-157 (29). Като се имат предвид тези роли на органични киселини в изпражненията и нашите открития, ниските фекални нива на органични киселини могат да бъдат вредни, причинявайки влошаване на гликемичния контрол чрез намаляване на секрецията на инкретинов хормон след хранене и повишена податливост към инфекция при пациенти с диабет тип 2 (28, 30).

Клиничното значение на Грам-положителната бактериална транслокация при пациенти с диабет тип 2 остава неизвестно. В това отношение е важно взаимодействието между липотейхоевата киселина (LTA) и TLR-2 при производството на цитокини. LTA, грамположителен компонент на бактериалната стена се свързва с TLR-2 (33). Последни проучвания (34,35) съобщават, че LTA подобрява експресията на IL-6 в различни клетки и нашето проучване демонстрира наличието на високи нива на IL-6 при пациенти с диабет тип 2. Разгледани заедно, са необходими допълнителни проучвания, за да се определи значението на транслокацията на Грам-положителни бактерии при системно възпаление, идентифицирано при пациенти със затлъстяване и диабет тип 2.

Настоящото проучване има определени ограничения. Първо, не е проведен орален тест за глюкозен толеранс от 75 g при контролни субекти, за да се изключи напълно наличието на диабет. Следователно контролните субекти в нашето проучване не могат да бъдат обозначени със сигурност като недиабетни контролни субекти. Нивата на HbA1c обаче при всички субекти не надвишават 6,0% (42 mmol/mol). Второ, не успяхме да потвърдим причинно-следствената връзка между чревната дисбиоза и бактериалната транслокация, тъй като нашето проучване беше с напречно сечение по дизайн. Трето, тъй като пациентите с диабет тип 2 са с наднормено тегло или със затлъстяване, не може да се изключи, че чревната дисбиоза и бактериалната транслокация се дължат на затлъстяване. Във връзка с това разделихме пациентите с диабет на две групи, групата със затлъстяване (ИТМ ≥25 kg/m 2) и групата, страдаща от затлъстяване (BMI 2). Няма значителни разлики в степента на откриване на кръвни бактерии. Тези данни подкрепят идеята, че затлъстяването не е основната причина за разликите. Четвърто, нашето проучване имаше малък размер на извадката.

Въпреки че тези ограничения трябва да бъдат взети под внимание, нашите открития имат потенциала да предоставят нова представа за патофизиологичните механизми на диабет тип 2. Необходими са по-нататъшни широкомащабни проучвания върху чревната и кръвната микробиота при японски пациенти с диабет тип 2.

В заключение, нашите резултати демонстрират чревна дисбиоза и възможна транслокация на бактерии в кръвта при пациенти с диабет тип 2. Следващата стъпка в този изследователски протокол е да се извършат интервенционни проучвания, за да се изследва дали подобряването на чревната дисбиоза чрез интервенции в начина на живот или прилагането на пробиотици може да намали нивата на маркерите на циркулаторното възпаление и скоростта на бактериална транслокация, с подобряване на гликемичния контрол.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на Норикацу Юки, Акира Такахаши и Юкико Кадо от Централния институт за микробиологични изследвания на Якулт, които помогнаха при анализа на събраните проби. Авторите също така благодарят на Джо Мацуока, биостатист от Центъра за клинични изследвания, Университетско висше училище по медицина Juntendo, който консултира статистическия анализ.

Принос на автора. J.S. и А.К. изследва данните, участва в събирането на данни, анализира данните, допринася за дискусията и пише и редактира ръкописа. F.I., T.Y., H.G., H.A., K.K., M.K., T.S., T.O., Y.T., Y.S., R.Y., T.M., Y.F. и H.F. участваха в събирането на данни и допринесоха за дискусията. K.N., T.T. и T.A. проектира проучването, анализира данните и редактира ръкописа. T.H. проектира проучването и допринесе за дискусията. S.N. допринесоха за дискусията. Y.Y. проектира проучването, допринесе за дискусията и редактира ръкописа. H.W. изследва данните, участва в събирането на данни, допринася за дискусията и редактира ръкописа. А.К. е гарант за тази работа и като такъв е имал пълен достъп до всички данни в проучването и поема отговорност за целостта на данните и точността на анализа на данните.

Предварително представяне. Части от това проучване бяха представени в абстрактна форма на 73-та научна сесия на Американската диабетна асоциация, Чикаго, Илинойс, 21-25 юни 2013 г.