Резюме

Заден план

Рискът от рак на панкреаса, четвъртият най-смъртоносен рак за мъжете и жените в САЩ, се увеличава от затлъстяването. Ограничаването на калориите (CR) е добре известен хранителен режим, който предотвратява или обръща затлъстяването и потиска туморогенезата при различни животински модели, поне отчасти чрез инхибиране на сигнализирането на мишена на рапамицин (mTOR) при бозайници. Аминокиселините с разклонена верига (BCAA), особено левцин, активират mTOR и засилват растежа и пролиферацията на миоцитите и епителните клетки, поради което левцинът е популярна добавка сред спортистите. Левцинът все по-често се използва като лечение за кахексия на рак на панкреаса, но ефектите от добавката на левцин върху растежа на тумора на панкреаса не са изяснени.

Резултати

Допълването с левцин увеличава растежа на тумора на панкреаса и в двете слаби (104 ± 17 mm 3 срещу 46 ± 13 mm 3; P 3 срещу 230 ± 39 mm 3; P

Заден план

Аминокиселините с разклонена верига (BCAA), които представляват над 20% от общия прием на протеини в храната, са известни активатори на пътя на mTOR в мускулните и епителните тъкани [14–16]. От трите BCAA левцинът оказва най-мощен ефект върху mTOR активирането и засилването на протеиновия синтез в различни тъкани, включително скелетните мускули [17, 18]. Спортистите обикновено използват добавки с левцин, за да активират mTOR-регулиран протеинов синтез и да ускорят възстановяването и регенерацията на мускулите след наранявания или интензивни пристъпи на упражнения [19]. Добавките с левцин също се препоръчват все по-често, за да се намали загубата на мускули, което се случва при ракова кахексия [20]. Кахексията се характеризира с неволна загуба на тегло и загуба на мускули, свързана е с повишена заболеваемост и смъртност и често се среща при пациенти с рак на панкреаса [21]. Доказано е, че увеличеният синтез на мускулен протеин в отговор на индуцирана от левцин активиране на mTOR инхибира мускулната загуба при миши модели на ракова кахексия и при пациенти с рак [22–25]. Въпреки това, скоростта на протеинов синтез се увеличава в много по-голяма степен при тумори, отколкото в мускулите [24], което предполага, че докато добавката на левцин може да предпази от свързаната с рака кахексия, тя може също да подобри прогресията на рака.

За съжаление, проучванията на ефектите на добавките с левцин върху рака са ограничени. Дългосрочните добавки с левцин (2% от диетата, т/т) насърчават развитието на рак на пикочния мехур при плъхове, лекувани с известен канцероген на пикочния мехур [26, 27], но няма проучвания, свързващи добавките с левцин с растежа на тумора. В настоящото проучване тествахме ефекта от добавката на левцин върху трансплантирания растеж на рак на панкреаса на мишка Panc02 и сигнализиране за mTOR в контекста на слаби мишки (хранени с CR режим на хранене) или мишки с наднормено тегло (хранени с висококалорична диета). Нашите открития показват, че левцинът подобрява прогресията на тумора на панкреаса при слаби и с наднормено тегло мишки и основните механизми могат да се различават според състоянието на теглото.

Методи

Мишки и диетични интервенции

На 27 седмици на диета, мишките са гладували 12 часа и след това са упоени чрез вдишване на CO2. След това са претърпели сърдечна пункция за вземане на кръв и впоследствие са били убити от цервикална дислокация. Панкреатичните тумори бяха събрани и бързо замразени в течен азот и съхранявани при -80 ° C, или фиксирани с 10% неутрално буфериран формалин за една нощ, превключени на 70% етанол, вграден парафин, впоследствие използвани за имунохистохимични анализи.

Серумни хормони

След прекратяване на проучването, серумните нива на инсулин и лептин се анализират, като се използват мултиплексирани тестове на базата на зърна Lincoplex ™ (Millipore, Billerica, MA, САЩ; MADPK-71 K-07). Серумният адипонектин и IGF-1 се определят количествено чрез единични комплекти за анализ (Millipore; MADPK-71 K-ADPN и RMIGF187K, съответно). Всички анализи бяха анализирани с помощта на анализатор BioRad Bioplex ™ (BioRad, Hercules, CA, USA) съгласно указанията на производителя.

Имунохистохимични анализи

Инвитро проучвания

Panc02 клетките се култивират в инкубатор при 37 ° C под 5% CO2 с 5A среда на McCoy's с глутамин (HyClone, Logan, UT, USA) и 3 g/L глюкоза, но без BCAA и след това се допълват с пеницилин/стрептомицин, несъществени аминокиселини, натриев пируват, HEPES, 10% инактивиран с топлина FBS (HyClone) и физиологични нива на левцин, изолевцин и валин (MP Biomedicals, Санта Ана, Калифорния, САЩ) [32]. За Western blotting, приблизително 100 000 Panc02 клетки бяха засяти в 6-ямкови плаки и оставени да се утаят за една нощ в 5A среда на McCoy’s с 10% FBS. След това клетките се третират с McCoy’s 5A плюс 10% FBS с или без добавка на левцин и McCoy’s 5A плюс 1% FBS с или без добавка на левцин (MP Biomedicals, Санта Ана, Калифорния, САЩ). За Western blot анализ, клетките се третират в продължение на 20 минути с 0,3 тМ левцин след 3 часа предварителна обработка на средата.

Уестърн блотинг

Анализ на клетъчна пролиферация

Клетъчната жизнеспособност беше измерена чрез 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолиев бромид (MTT) Комплект за анализ на клетъчната пролиферация (Trevigen, Gaithersburg, MD; 4890-025-K) . В 96-ямкови плаки Panc02 (1500 клетки/гнездо) в среда се оставя да залепне за една нощ. Всяка ямка беше пълна с прясна среда за третиране, допълнена с различни количества FBS (10% или 1%) и левцин (0 или 0.3 тМ). След това клетките се инкубират в продължение на 24 часа при 37 ° С, излагат се на свежа обработваща среда след отстраняване на старите среди и се инкубират в продължение на допълнителни 24 часа. MTT се добавя в съотношение 1:10 за 2 h, след това течността се аспирира и 100 μL диметил сулфоксид (DMSO) се добавя за лизиране на клетките и разтваряне на твърдия остатък. Оптичната плътност на всяка ямка при 570 nm и 690 nm, референтна дължина на вълната, беше определена с помощта на Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader и софтуер за анализ на данни Gen5 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). След това се изчислява относителната жизнеспособност на клетките, като се използва абсорбцията на клетки, отглеждани в среда с 10% FBS и без добавка на левцин за нормализиране. Показаните данни представляват средната стойност на три биологични повторения.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха проведени с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Временните разлики между групите по отношение на телесното тегло и енергийния прием бяха оценени чрез анализ на многократни мерки; окончателните измервания бяха сравнени, като се използва еднопосочен ANOVA и post hoc тест за значимост на Newman-Keul. Нивата на кръвната глюкоза във всяка точка от времето се сравняват, като се използва еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест за значимост на Newman-Keul, а общите разлики в кръвната глюкоза се сравняват чрез извършване на еднопосочен ANOVA върху изчислени площи под кривата, последвана от Newman-Keul's post hoc тест за значимост. Нивата на серумния хормон на претумора, процента телесни мазнини, чиста маса и глюкоза на гладно на 21-та седмица се сравняват с еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест за значимост на Newman-Keul. Окончателни измервания на ex vivo обемът на тумора и имунохистохимичното оцветяване на всички антитела също се сравняват между групите чрез еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на значимостта на Newman-Keul. За да се сравнят ефектите от добавянето на левцин в среда с 10% FBS или 1% FBS, Western blot денситометрията и относителната жизнеспособност на клетките в съответните им времеви точки са сравнени чрез двустранни t-тестове. Резултатите се считат за значими, ако P

Резултати

Ефекти от ограничаването на калориите и добавките на левцин върху телесния състав, хомеостазата на глюкозата и серумните хормони

Мъжки мишки C57BL/6 са били хранени с контролна диета със или без добавка на левцин, или 30% CR диета със или без добавка на левцин, в продължение на 27 седмици (включително 21 седмици диета преди извършване на GTT и qMR). В сравнение с контролните мишки, CR мишките имат значително намален калориен прием (n = 22/група; P Фигура 1

растежа

На 21 седмица от проучването групата CR без добавка на левцин, спрямо контролите без добавка на левцин, показва повишен глюкозен клирънс, оценен от GTT (n = 10/група; P 0,05) (Фигура 1Е). Дори на 6 седмици, добавките с левцин показват същата тенденция за инхибиране на глюкозния клирънс при мишки на контролната диета (вж. Допълнителен файл 1). Групата за диета CR без добавка на левцин показва значително по-ниски нива на серумна глюкоза на гладно спрямо контролите (контролна група, n = 14; CR група, n = 15; P 0,05).

CR мишките без добавка на левцин, в сравнение с контролните мишки без добавка на левцин, имат значително по-ниски серумни нива на IGF-1 (контролна група, n = 9; CR група, n = 10; P 0,05) (Фигура 1G). Добавянето на левцин понижава IGF-1 в контролната група (n = 9/група; P Фигура 2

Влиянието на енергийния баланс и добавките на левцин върху клетъчната пролиферация се оценява в туморните тъкани чрез имунохистохимично оцветяване срещу Ki-67 (Фигура 2В). Докато CR значително намалява клетъчната пролиферация, спрямо контролната диета, при недопълнени мишки (n = 5/група; P Фигура 3

Добавката на левцин в контролната диета не променя значително количествата на тези междинни продукти, отговарящи на енергията. Въпреки това, добавките с левцин в диетата с CR значително намаляват p-ACC (n = 5/група; P Фигура 4

Ефект на добавката на левцин върху междинните продукти на mTOR

За да се разбере диференциалният отговор на добавките на левцин между диетичните групи по отношение на mTOR сигнализиране, инвитро анализите бяха проведени с помощта на Panc02 клетъчни линии. Уестърн блот анализите за междинните продукти, отговарящи на енергията p-AMPK, p-ACC, p-mTOR, p-p70S6K и p-S6, разкриват, че ефектите на добавката на левцин върху междинните съединения за клетъчна сигнализация са повлияни от наличието на растежен фактор. В среда, богата на растежен фактор на среда с 10% FBS, добавянето с 0,3 тМ левцин няма ефект върху фосфорилиран AMPK, ACC, mTOR, p70S6K или S6 рибозомен протеин (Фигура 5А, В). При настройката на 1% FBS добавката на левцин няма ефект върху фосфорилиран AMPK или ACC, но значително увеличава фосфорилирания mTOR (P Фигура 5

Дискусия

Констатациите в този доклад показват за първи път, че хранителните добавки с левцин увеличават растежа на туморите на панкреаса. По-конкретно, ние показваме, че добавките с левцин не само засилват протуморигенната природа на висококалоричната диета с високо съдържание на въглехидрати, но и частично преодоляват добре установените противоракови ефекти на CR. Механизмите, залегнали в основата на тези индуцирани от левцин протуморни ефекти, могат да зависят от диетата, предполага се от повишена наличност на глюкоза при мишки с наднормено тегло и повишено активиране на синтетичния път на mTOR протеин при CR мишки.

Заключения

Този доклад установява, че хранителните добавки с левцин, независимо от състоянието на енергийния баланс, насърчават растежа на тумора на панкреаса. Тези открития предполагат предпазливост по отношение на клиничната употреба на добавки с левцин за целите на подобряване на чистата мускулатура при пациенти с кахектичен рак. Необходими са допълнителни изследвания, за да се установи влиянието на аминокиселините (BC или по друг начин) върху растежа на рака и възстановяването на мускулите; идентифициране на mTOR-независими подходи за щадене на мускулите при пациенти с кахектичен рак; и връзката между енергийния баланс, mTOR сигнализирането и метаболизма на аминокиселините.