• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: b.a.reynolds @ gmail.comloic.deleyrolle @ neurosurgery.ufl.edu

Резюме

Предназначение: Дисрегулираната енергетика, съчетана с неконтролирано разпространение, се превърна в отличителен белег на рака, което доведе до повишен интерес към метаболитните терапии. Глиобластомът (GB) е силно злокачествен, много метаболитно активен и обикновено устойчив на настоящите терапии. Възможностите за диетично лечение въз основа на лишаване от глюкоза са проучени с помощта на рестриктивна кетогенна диета (KD), с положителни доклади за противоракови заболявания. Обаче отрицателните странични ефекти и липсата на вкус правят KD труден за прилагане при възрастна популация. Следователно, ние разработихме по-малко строга, допълнена диета с високо съдържание на мазнини с ниско съдържание на въглехидрати (sHFLC), която имитира метаболитните и антитуморни ефекти на KD, поддържа стабилен хранителен профил и представлява алтернативна клинична възможност за различни популации пациенти.

високо

Експериментален дизайн: Диетичната парадигма е тествана in vitro и in vivo, като се използват множество линии на глиомасфера, получени от пациента. Клетъчната пролиферация, клоногенната честота и ефектите на популацията на туморни стволови клетки се определят in vitro с помощта на невросферния анализ (NSA). Антитуморната ефикасност е тествана in vivo в предклинични ксенографтни модели и е изследвана механистична регулация по пътя на mTOR.

Резултати: Намаляването на глюкозата in vitro до физиологични нива, заедно с добавките с кетони, инхибира пролиферацията на GB клетки и намалява разширяването на туморните стволови клетки. In vivo, като същевременно поддържа здравето на животните, sHFLC диетата значително намалява растежа на туморните клетки в подкожен модел на прогресия на тумора и увеличава преживяемостта в ортотопичен ксенографтен модел. Диетично-медиираните противоракови ефекти корелират с намаляването на mTOR ефекторната експресия.

Транслационна релевантност

Възникващата роля на метаболизма при много видове рак предоставя нова цел за нови терапевтични средства. Възможност са диетичните терапии, предназначени да се възползват от уникалните енергийни нужди на туморните клетки. Един такъв вариант е използването на диета с много мазнини и ниско съдържание на въглехидрати (съответно 90%: 5%), наречена кетогенна диета (KD). Тази диета се използва за лечение на епилепсия в продължение на почти 90 години и наскоро беше проучено приложението й като противораково средство. Въпреки че предклиничните проучвания показват неговата ефикасност и докладите от клинични случаи подкрепят неговата осъществимост, KD е трудно да се приложи поради строгия си характер. Тук докладваме развитието на sHFLC, който имитира основните физиологични ефекти на KD, а именно намалена глюкоза и повишени кетони. В допълнение, диетата sHFLC е в състояние да намали пролиферацията на туморни клетъчни глиобластоми (GB) и да удължи продължителността на живота при GB животински модели.

Въведение

Глиобластомът (GB) е най-често срещаният глиом с висока степен при възрастни, с изключително лоша прогноза. Подобни на пипала проекции и псевдопализадизираща некроза се интегрират в нормалната мозъчна тъкан, което затруднява пълната хирургична резекция. Екстремната клетъчна хетерогенност, обширните генетични отклонения и неадекватното ранно откриване правят ефективен дългосрочен контрол на GB предизвикателен. Настоящият стандарт на грижи (SOC) се ограничава до хирургия, лъчетерапия и химиотерапия (темозоломид/TMZ), със средна преживяемост от 9 до 12 месеца и 5-годишна преживяемост под 5%.

Метаболизмът на глюкозата и ефектът на Варбург се наложиха като потенциална туморна слабост и използваема зона за лечение. Когато нормалните клетки използват глюкоза за производство на енергия с висок добив в митохондриите (1: 36ATP), туморните клетки изискват по-високи нива на глюкоза за намалено производство на енергия, чрез лактат в цитозола (1: 4ATP) и синтез на нуклеотиди в пътя на пентозата фосфат . Тази метаболитна характеристика, наречена ефект на Варбург, е съществен страничен продукт от бързата клетъчна пролиферация и се насърчава по време на туморогенезата чрез онкогенно метаболитно препрограмиране. Следователно туморните клетки придобиват способността да поддържат пролиферативни сигнални механизми, което впоследствие насърчава злокачествената гликолиза (2). Пътят PI3K/Akt/mTOR играе централна роля при раковите заболявания на човека чрез конститутивна активност, повишена експресия на растежен фактор и гликолитично активиране, което води до цикли на консумация, пролиферация и оцеляване на глюкозата (3). PTEN, ключов регулатор на пътя PI3K/Akt/mTOR, често се деактивира в GB.

Изследванията на нерегулиран клетъчен метаболизъм породиха схващането, че диетичните терапии за пациенти с рак могат да имат значителна клинична полза. GB е предложено да бъде обещаващ кандидат за диетична интервенция поради значителната си зависимост и използване на глюкоза (4, 5). В челните редици на диетичната противоракова терапия е кетогенната диета (KD), която представлява диета с високо съдържание на мазнини, ниско съдържание на въглехидрати и ниско съдържание на протеини, използвана в продължение на десетилетия за лечение на рефрактерни епилептични припадъци. Екстремното ограничаване на въглехидратите имитира състояние на гладно, което води до намаляване на кръвната глюкоза и индукция на кетонни тела (напр. Β-хидроксибутират/BHB; справка 6). Кетонните тела са подходящи енергийни заместители за нормални клетки с функционални митохондрии (7), но е доказано, че са неподходящи за туморни клетки (8,9), тъй като митохондриалните функции на туморните клетки не са регулирани (10). Съществуващите предклинични данни подкрепят KD (11–13) и KD с ограничена калория (RKD; справки 14, 15) при лечението на рак на мозъка чрез намаляване на растежа на тумора и увеличаване на преживяемостта на животните. Клинични доклади (5), доклади от случаи (16,17) и пилотни проучвания (18–20) показват, че KD е безопасен, има ниска токсичност и е приложим за пациенти с рак.

Тези публикации отбелязват, че има пречки при употребата му като лечение на рак поради нежеланието за продължителна употреба, като някои от тях съобщават за леки до тежки странични ефекти (21). Предложено е да се разработят и тестват по-трайни диетични режими, тъй като не всички пациенти могат да толерират едни и същи диетични ограничения (22). Следователно ние се стремихме да разработим по-малко рестриктивна диета, подобна на KD, която да показва същия физиологичен фенотип и антитуморна ефикасност. Чрез допълване на високомаслена, нисковъглехидратна (sHFLC), умерена протеинова диета със специализирани средноверижни триглицериди [MCT; 60% (30%): 30%: 10%: Мазнини (MCT): Протеини: Въглехидрати], предполагаме, че може да се приложи по-балансирана диета, което води до намалена прогресия на тумора. MCTs са специално избрани въз основа на дължините на въглеродната верига (C8: C10: 97%: 3%), които им позволяват бързо да дифундират от стомашно-чревния тракт в чернодробната портална система и да пътуват директно до черния дроб, където се превръщат в кетонни тела (6). Ние вярваме, че е възможно да се осигури по-пълноценна, гъвкава и вкусна противоракова диета с sHFLC, която би могла да насочи към разнообразна популация пациенти и да увеличи спазването на пациентите.

Материали и методи 1

Клетки

Пациентите на тумори на глиобластома са дисоциирани и култивирани, както е публикувано по-рано (23). Всички линии са тествани и удостоверени чрез STR-профилиране след протоколи ICLAC. Културните среди са без серум, допълнени с EGF при 20 ng/mL. Средата с ограничена глюкоза беше тествана с глюкометър и допълнена с глюкоза при нанасяне и през ден за 7-дневния цикъл на преминаване. BHB се прилага в средата само в деня на полагане и се измерва на ден 1 и преминаване на ден 7 с помощта на измервателния уред OneTouch.

Изображения

След образуването на сфери клетките бяха фиксирани с PFA, оцветени с DAPI и изобразени с помощта на Leica DM 2000 2.5 × флуоресцентен микроскоп. Изображенията са количествено определени с помощта на Macnification.

Животни

Всички експерименти са одобрени от IACUC. Животните с NOD/SCID бяха настанени при стандартни животновъдни процедури. Трансплантации: Животните са трансплантирани съгласно предварително публикувани протоколи (24). За подкожни ксенотрансплантати бяха трансплантирани дисоциирани глиомасфери (1 × 106). Използвани са критерии за крайна точка 15 × 15 mm (1766 mm 3). За интракраниални ксенотрансплантати животните се инжектират стереотактично с дисоциирани глиомасфери (2 × 105) в стриатума (2 ML и 2,5 DV). Критериите за крайна точка бяха> 20% загуба на телесно тегло, BCS ≤2 и неврологичен дефицит.

Създаване и доставка на диета

Кетогенната диета е готова Bioserv # F3666. SHFLC и контролните диети са създадени с помощта на съставки от Purina Test Diet. Крайният калоричен% на диетата sHFLC е 10:30:30 (30) въглехидрати: протеини: мазнини (MCTs; 3,2: 2,8: 1 мазнини: протеини: въглехидрати). Диетата sHFLC осигурява 5,66 kcal/g брутна енергия, където мазнините, въглехидратите, протеините и фибрите съдържат съответно 404 g/kg, 125 g/kg, 355 g/kg, 73,12 g/kg. Контролната диета калорични% е 55:20:25 въглехидрати: протеини: мазнини (1: 1,8: 4,9 мазнини: протеини: въглехидрати). Контролната диета доставя 4,67 kcal/g брутна енергия, където мазнините, въглехидратите, протеините и фибрите съдържат съответно 115 g/kg, 570 g/kg, 208 g/kg, 72 g/kg. Храната (ad libitum) се променя ежедневно. При палпация на SC тумор, (1 × 1 mm) животни бяха рандомизирани и им беше назначена съответната диета. Вътречерепните животни са рандомизирани след трансплантация и им е назначена съответната диета 5 дни след окончателната трансплантация.

Заетост на тумора

Количественото определяне на заетостта на тумора беше определено с помощта на ImageJ. Три изображения за всеки мозък (4 контролни, 3 sHFLC, 3 KD) са направени от рострално, медиално и опашно положение на тумора.

Тъканите бяха фиксирани с формалдехид, криоконсервирани или вградени в парафин. Секциите бяха блокирани и инкубирани в първично антитяло за една нощ при 4 ° С. Флуоресцентно вторично антитяло се прилага за 1 час при RT. Слайдовете бяха покрити с използване на VectaShield с DAPI. Биотинилирано вторично антитяло се прилага за 2 часа при RT, последвано от 1 час комплект Vectastain Elite ABC и комплект DAB пероксидаза. Слайдовете бяха покрити с Cytoseal.

Western blot анализ

Протеините бяха извлечени от подкожни тумори и количествено определени с помощта на Qubit. Във всяка ямка се зареждат равни количества протеин (20-40 μg). Геловете се пускат в продължение на 30 минути при 200 V и след това се прехвърлят с помощта на xCell-II блотен модул (1 час, 35А, RT). Протеините, които представляват интерес, бяха открити с помощта на хемолуминесценция. Мембраните бяха изложени (Kodak), оголени и изследвани за актин.

Проточна цитометрия

Клетки от култура и ex-vivo клетки от SC тумори се пускат на поточен цитометър BD Biosciences LSRII. Накратко, 0,5 х 106 клетки бяха блокирани, проникнати и инкубирани с първични антитела за една нощ при 4 ° С. Вторично антитяло се прилага за 1 час при RT. Анализът на потока беше извършен с помощта на софтуера FlowJo.

РНК изолация и RT 2 PCR Human mTOR Profiler

Обща РНК е изолирана от SC тумори с помощта на RNeasy Plus Mini RNA изолационен комплект. Използвани са първите направления RT 2 и RT 2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix. RT-PCR се извършва с помощта на Qiagen (PAHS-098ZE-4), на ABI 7900HT. Домакинските гени бяха определени с помощта на NormFinder.

Резултати

Ограничената глюкоза забавя пролиферацията на глиомасфери, получени от пациента

Диетата sHFLC намалява mTORC1/2 сигнализирането. A, клъстерграма от 78 избрани mTOR-свързани гени от Qiagen RT 2 Profiler с 86 ключови mTOR гени. Цветовият градиент на клъстерграмата показва последователно регулиране на пътя на mTOR. Клъстерграмата има четири различни животински тумора от контролната група и групите, хранени с sHFLC. Анализираните тумори бяха трансплантирани подкожно глиомасфери от линия 0, получени от пациент. В, таблица със значими P стойности на избрани mTORC1/2 субстратни гени, групирани във функционални групи. Домакинските гени бяха определени с помощта на NormFinder и нормализирани с помощта на софтуера за анализ на Qiagen. Статистика, извършена с помощта на тест на Student.

Нашата работа показва, че има различна връзка между метаболизма и разпространението, която може да бъде използвана чрез промяна на енергийните източници в тялото. По-нататъшното изследване на биохимичните реакции на метаболитните междинни продукти може да хвърли повече светлина върху това как кетонните тела се използват диференцирано от туморните клетки, тъй като ролята на митохондриите в разпространението на тумора и канцерогенезата е многостранна и не е напълно разбрана. Независимо от това, ние ефективно показваме, че комбинация от ниска глюкоза и високи кетони води до отрицателни пролиферативни ефекти върху глиомасферите, които могат да бъдат преведени in vivo с диетата sHFLC. Тази диета намалява общото натоварване на тумора и увеличава преживяемостта, еквивалентна на строг 1: 6 KD, и има пълен хранителен профил. Следователно ние предлагаме, че диетичната терапия, като sHFLC диетата, може да се използва при управлението на GB.

Разкриване на потенциален конфликт на интереси

Не са разкрити потенциални конфликти на интереси.

Принос на авторите

Концепция и дизайн: R.T. Martuscello, V. Vedam-Mai, C.L. Skinner, L. P. Deleyrolle, B.A. Рейнолдс

Разработване на методология: R.T. Martuscello, C.L. Скинър, О. Суслов, Л. П. Делейрол, Б. А. Рейнолдс

Придобиване на данни (предоставени животни, придобити и управлявани пациенти, осигурени съоръжения и др.): R.T. Martuscello, D.J. McCarthy, M.E. Schmoll, C.D. Louviere, B. Griffith, C.L. Скинър, Б.А. Рейнолдс

Анализ и интерпретация на данни (напр. Статистически анализ, биостатистика, изчислителен анализ): R.T. Martuscello, V. Vedam-Mai, M.A.Jundi, C.D. Louviere, L.P.Deleyrolle, B.A. Рейнолдс

Написване, преглед и/или преразглеждане на ръкописа: R.T. Martuscello, V. Vedam-Mai, L.P.Deleyrolle, B.A. Рейнолдс

Административна, техническа или материална подкрепа (т.е. докладване или организиране на данни, изграждане на бази данни): R.T. Martuscello, D.J. McCarthy, C.D. Louviere, O. Suslov, L.P. Deleyrolle, B.A. Рейнолдс

Надзор на проучването: V. Vedam-Mai, L. P. Deleyrolle

Друго (Изпратено от Regina Martuscello по отношение на всички изображения в този ръкопис): Б.А. Рейнолдс

Безвъзмездна помощ

Тази работа беше финансово подпомогната от Мозъчен институт на Мак Найт, Катедра по неврохирургия (към BA Reynolds), Флоридски център за изследване на мозъчен тумор (към BA Reynolds), Национално общество за мозъчен тумор (към BA Reynolds), NIH - NINDS R24 NS086554-01 (до BA Reynolds), NIH/NCI - R21 CA141020-01 (на BA Reynolds) и Американското общество за борба с рака Chris DiMarco Institution Research Grant (на LP Deleyrolle).

Благодарности

Авторите благодарят на всички членове на лабораторията B.A.R и доброволци за тяхното съдействие, по-специално Андрю Неапол, Джеймс Макгиъни, Линдзи Часън, Хънтър Фътч и Гретър Диас. Авторите също така благодарят на източниците си на финансиране и основните съоръжения на мозъчния институт McKnight за поточна цитометрия и ядрото за клетъчен и тъканен анализ (CTAC), в допълнение към Медицинския колеж на Университета във Флорида и Интердисциплинарната програма по биомедицински науки и FCBTR за проби от мозъчен тумор.

Бележки под линия

Забележка: Допълнителни данни за тази статия са на разположение на Clinical Cancer Research Online (http://clincancerres.aacrjournals.org/).

↵ 1 За подробни експериментални процедури вижте файла с допълнителни методи.