Ананди Нараяна Мурти

1 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет, Национален университет в Сингапур, Национална университетска здравна система, Сингапур

Конг Бинг Тан

2 Катедра по патология, Национална университетска болница, Национален университет в Сингапур, Национална университетска здравна система, Сингапур

Ши Уанг

2 Катедра по патология, Национална университетска болница, Национален университет в Сингапур, Национална университетска здравна система, Сингапур

Teluguakula Narasaraju

3 Център за ветеринарни здравни науки, Държавен университет в Оклахома, Stillwater, ОК, САЩ

Винсент Т. Чоу

1 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет, Национален университет в Сингапур, Национална университетска здравна система, Сингапур

Резюме

Затлъстяването е независим рисков фактор за тежък изход от грипна инфекция. По-високата консумация на мазнини в храната е свързана с по-голяма заболеваемост и тежък грип при модели на мишки. Досега обаче степента на генериране на неутрофилни извънклетъчни капани (NETs или NETosis) при затлъстели индивиди по време на грипна пневмония досега е неизвестна. Това проучване изследва генерирането на белодробни NETs при мишки BALB/c, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), по време на грипната пневмония. Клиничната прогресия на заболяването, хистопатологията, белодробните реактивни кислородни видове и активността на миелопероксидазата също са сравнени. Консумацията на HFD в продължение на 18 седмици води до значително по-високо телесно тегло, индекс на телесна маса и затлъстяване при мишки BALB/c в сравнение с LFD. Смъртоносното предизвикване на мишки (на HFD и LFD) с грипен A/PR/8/34 (H1N1) вирус доведе до подобна загуба на телесно тегло и хистопатологична тежест. Въпреки това, NETs се образуват при относително по-високи нива при мишки, хранени с HFD, въпреки липсата на значителна разлика в прогресията на заболяването между мишки, хранени с HFD и LFD.

Въведение

Неутрофилите освобождават неутрофилни извънклетъчни капани (NET), за да заловят и убият патогени, като бактерии и гъбички (1, 2), но ограничени проучвания разглеждат тяхната роля при вирусни инфекции (3-5). NETs могат да заловят и неутрализират HIV-1 по TLR7- и TLR8-зависим начин (4). От друга страна, когато мрежите присъстват в голям брой, те могат да причинят увреждане на тъканите чрез освобождаване на цитотоксични протеини в извънклетъчното пространство. По-рано разкрихме бурна инфилтрация на активирани неутрофили и широко генериране на белодробни NETs при смъртоносно предизвикване на мишки с грипен вирус, които допринасят за нараняване на белите дробове (6). Също така демонстрирахме връзката между белодробната NETosis и хистопатологичната тежест при мишки по време на летална пневмококова суперинфекция след грипна белодробна инфекция (7, 8). Тези проучвания подчертават патологичната роля на белодробните NET по време на грипна пневмония.

Затлъстяването е свързано с хронично нискостепенно възпаление (9). Излишъкът на хранителни вещества ограничава кръвоснабдяването на адипоцитите, което води до хипоксия, която може да предизвика некроза и макрофагична инфилтрация на мастната тъкан, което от своя страна води до свръхсекреция на провъзпалителни цитокини (10, 11). Самите адипоцити секретират адипокини, като TNF-α и IL-6, които са провъзпалителни и свързани с различни метаболитни състояния (12, 13). Увеличена периферна неутрофилна активност, като генериране на супероксид, се наблюдава при здрави затлъстели индивиди и може да се отдаде на цитокини, като IL-8, секретиран от адипоцитите (14, 15). Въпреки че провъзпалителните цитокини, като TNF-α и IL-8, могат да индуцират NETosis (1, 16), ефектите на затлъстяването и свързаното с тях възпаление върху NETosis все още са неясни.

Затлъстяването е документирано като независим рисков фактор за усложнения, произтичащи от тежък грип по време на пандемията H1N1 през 2009 г. (17, 18). По-ранните модели на мишки с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) също свързват степента на затлъстяване с тежък грипен изход и произтичащата от това белодробна патология и имунна дисфункция (19–21). Досега не е известна връзката между белодробната NETosis и резултата от грипната пневмония при затлъстели лица. Като се има предвид, че мастните тъкани благоприятстват провъзпалителна среда, която потенциално може да активира неутрофили, ние предполагаме, че по-високата адипозия може да допринесе за по-голямо образуване на белодробни NET, което влошава патологичния резултат от грипната пневмония. Целта на това проучване беше да се изследват и сравнят ефектите от диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) спрямо диетата с ниско съдържание на мазнини (LFD) върху степента на NETosis в белите дробове на мишки BALB/c по време на летално инфлуенчно предизвикателство.

Материали и методи

Животни, етика и режим на хранене

Всички експерименти с животни са извършени съгласно разпоредбите на Институционалния комитет за грижи и употреба на животните, Национален университет в Сингапур (номер на протокол 050/11). Четириседмични мъжки мишки BALB/c бяха аклиматизирани за 1 седмица със стандартна чау преди да започнат планирана диета (Research Diets). Мишките бяха разделени на случаен принцип в две групи, т.е. всяка група беше хранена с LFD (10% kcal от хранителни мазнини) или HFD (45% kcal от хранителни мазнини) в продължение на 18 седмици. Всяка седмица се осигуряваха пресни фуражи. Телесното тегло, ИТМ [тегло (g)/дължина от носа до ануса (mm 2)] и приема на храна се измерват ежеседмично. Консумираните калории се изчисляват въз основа на консумираната храна (т.е. 1 g LFD = 3.85 kcal; 1 g HFD = 4.73 kcal). Нивата на кръвната глюкоза са измервани с помощта на глюкометър Accu-Check Performa (Roche) в началото и в края на 18-седмичния хранителен режим. В края на 18-те седмици бяха взети органи като бели дробове, мозък, бъбреци, сърце, черен дроб, далак, бяла мастна тъкан (WAT) на половите жлези, периреналните области и междулопаточната кафява мастна тъкан (IBAT) от двете групи мишки, претеглени и разделени за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E).

Инфекция на мишки с грипен вирус

Грипният вирус A/Пуерто Рико/8/34 (H1N1) щам (PR8) от Американската колекция от типови култури се размножава в ембрионирани яйца, както е описано по-горе (7). След 18-седмичния хранителен режим, мишките от двете диетични групи бяха интратрахеално предизвикани с летална доза PR8 вирус, т.е. 50 единици, образуващи плаки (PFU). Анестезията се извършва, като се използват 75 mg/kg кетамин и 1 mg/kg медетомидин, и се обръща, като се използва атипамезол хидрохлорид (5 mg/ml). Контролните мишки получават само буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS). Мишките бяха евтаназирани на 6 и 10 дни след инфекцията (DPI), белите им дробове бяха изрязани, като единият лоб беше фиксиран в 4% параформалдехид, докато другият лоб беше бързо замразен за следващи анализи.

Хистопатологично точкуване на белодробна тъкан

Фиксираните с формалин бели дробове бяха дехидратирани и вградени в парафин. Белодробните участъци (5 μm), оцветени с H&E, бяха подложени на хистопатологично точкуване по заслепен начин въз основа на модифицирани критерии (22). Крайният резултат за нараняване се изчислява по формулата: 1 × (алвеоларен кръвоизлив, 0–3) + 2 × (алвеоларен инфилтрат, 0–3) + 2 × (бронхиоларен инфилтрат, 0–3) + 2 × (фибрин, 0 –3) + 1 × (задръстване на алвеоларната преграда, 0–3), където 0–3 се отнасят до 0 = отсъства, 1 = леко, 2 = умерено и 3 = тежко.

NETs Оцветяване и количествено определяне в белодробната тъкан

Неутрофилните извънклетъчни капани в белодробните секции се определят количествено чрез тройно имуномаркиране, както е описано по-горе (7). Накратко белодробните секции (5 μm) бяха оцветени с антитела срещу хистон H2B (Abcam) и миелопероксидаза (MPO, Abcam) и DAPI (Life Technologies). NETs бяха идентифицирани като единични нишки или клъстери и бяха оценени съгласно предварително определени критерии (0–10). Бяха анализирани двадесет полета и сумата беше изчислена за крайния резултат от NETs.

Определяне на вирусни титри

Замразените белодробни тъкани се хомогенизират с помощта на нежния диспергатор на тъкани MACS (Miltenyi Biotech). Вирусните титри се определят чрез анализ на плаката, както е описано по-рано (23).

Анализи на водороден пероксид и миелопероксидаза

Концентрациите на водороден пероксид (H2O2) в белите дробове се измерват с помощта на комплекта за анализ на червения водороден пероксид/пероксидаза на Amplex (Invitrogen). MPO активността беше определена, както е описано по-горе (8). Накратко, 10 μl белодробен хомогенат се смесва с 190 μl прясно приготвен разтвор за анализ (26,9 ml H2O, 2,0 ml 0,1 M натриев фосфатен буфер рН 7,0, 0,1 ml 0,1 M H2O2 и 0,048 ml гваякол) и абсорбцията се отчита веднага при 470 nm за 1 min. MPO активността беше изчислена като единици/ml = (ΔO.D. × Vt × 4)/(E × Δt × Vs) × 2, където ΔO.D. = промяна на оптичната плътност, Vt = общ обем (милилитра), E = 26,6 mM -1 cm -1 (коефициент на екстинкция на тетрагуаяколов продукт), Δt = време на измерване (минути), Vs = обем на пробата (милилитра) и 2 е коефициентът на преобразуване в 1 cm дължина на пътя. Всички стойности бяха нормализирани до съдържанието на белодробен протеин, измерено по метода на Брадфорд (Bio-Rad).

Статистически анализи

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SPSS (версия 22). T-тестът на Student е използван за анализ на параметрични данни, докато U-тестът на Mann-Whitney е използван за непараметричен анализ на данни. ANOVA с Tukey post hoc корекция е използвана за сравнение на повече от две групи. Стойностите на Р по-малко от 0,05, 0,01 и 0,001 се считат за значими в различна степен.

Резултати

HFD мишките качват по-високо телесно тегло и телесни мазнини в сравнение с LFD мишки

Мишките с HFD показаха значително по-високи телесни тегла (P (Фигури 1А, В). 1 А, В). Въпреки че количеството консумирана храна обикновено е сходно между групите, HFD мишките консумират повече калории на мишка, отколкото LFD мишките, поради по-висок процент мазнини в HFD (P (Фигури 1C, D). 1 C, D). Нивата на кръвната им глюкоза обаче не разкриват значителна разлика (P = 0,239) (данните не са показани).

ефект

HFD мишките показват по-високи параметри на телесното тегло в сравнение с LFD мишките. Мишките BALB/c (на 5 седмици) са били хранени с HFD или LFD в продължение на 18 седмици. След приключване на тези диети, HFD мишките показват значително по-високи (А) наддаване на тегло и (Б) ИТМ. Макар че (° С) седмичният прием на храна на мишка е сравним между двете групи, (Д) действителните консумирани калории варират поради по-високото съдържание на мазнини в диетата в HFD. Стойностите представляват средните стойности ± SE на 15 мишки на диетична група (3 независими партиди), чрез ANOVA с Tukey post hoc корекция.

Мишките HFD също показват относително по-голямо натрупване на WAT в гонадалните (P = 0,1) и периреналните мастни възглавнички (P = 0,2), IBAT (P = 0,1) (Фигура (Фигура 2А). 2 A). Органите, като сърцето (P = 0,7) и бъбреците (P = 0,4), заедно с мастните възглавници показват относително увеличено тегло в сравнение с LFD мишки, макар и да не са статистически значими (Фигура (Фигура 2B). 2 B). Теглото на далака (P = 0,2), белите дробове (P = 1,0) и черния дроб (P = 1,0) са леко намалени при HFD мишки, докато теглото на мозъка (P = 1,0) е сравним между двете групи. Не се наблюдава значителна разлика в хистологията на мастната тъкан между двете групи (данните не са показани).

HFD мишките показват относително по-голямо натрупване на телесна мазнина в сравнение с LFD мишки. (А) Брутна анатомия на WAT и IBAT от LFD и HFD мишки. Мастните възглавнички (особено половите жлези) изглеждаха по-големи в групата с HFD. (Б) Мокри тегла на различни органи и мазнини на LFD и HFD мишки след съответната им 18-седмична диета. Стойностите представляват средните стойности ± SE на три мишки на диетична група (единична партида), по U-тест на Mann-Whitney.

Заразените HFD мишки имат относително повишен белодробен вирусен товар, но показват подобна белодробна патология като LFD мишки

При смъртоносно предизвикателство с грипен вирус А, както LFD, така и HFD мишките показват подобна загуба на телесно тегло (P (Фигура 3А). 3 A). Белодробните вирусни титри са били почти три пъти по-високи в групата с HFD, отколкото групата с LFD, макар и да не са статистически значими (P = 0,401) (Фигура (Фигура 3B). 3 B). Предишно проучване на DIO също наблюдава малко повишени вирусни титри на грип при HFD мишки, което показва, че затлъстяването оказва само незначително влияние върху вирусната репликация в гостоприемника (19). Въпреки че хистопатологичните анализи показват относително намаляване на общия резултат за тежест в заразената група с HFD при 6 DPI (P = 0,108), резултатът става сравним с заразената група с LFD с 10 DPI (P = 0,725) (Фигури (Фигури 3C, D) 3 С, D). И двете групи мишки показаха удебеляване на алвеоларните прегради, засилена възпалителна клетъчна инфилтрация в алвеоларното и бронхиоларното пространство и с 10 DPI, увеличено отлагане на алвеоларен фибрин.

Инфектираните HFD мишки показват подобна загуба на телесно тегло, но относително по-високи белодробни вирусни титри от заразените LFD мишки. Мишките бяха заразени със смъртоносна доза (50 PFU) грипен вирус A PR8 вирус и белите дробове бяха събрани на 6 и 10 DPI. (А) И двете групи заразени HFD (INF) и LFD (INF) мишки показват сходни нива на значителна загуба на телесно тегло, но не и контролни мишки (MOCK), получаващи PBS. (Б) Вирусните титри са били относително по-високи в заразената HFD група при 6 DPI. Не е открит вирус при 10 DPI. (C, D) Резултатите за хистопатологична тежест между заразените групи не се различават значително. AV, алвеоли. Увеличение: панели = 100 ×, вложки = 1000 ×. Стойностите представляват средните стойности ± SE на пет мишки на група (два независими експеримента). Използва се t-тест на Student за определяне на вирусен титър и ANOVA с Tukey post hoc корекция за телесно тегло и хистопатологични анализи.

Относително засилено образуване на белодробни ROS и NETs при заразени HFD мишки

Концентрацията на H2O2 в белите дробове е относително по-висока при заразени HFD мишки при 6 DPI (P = 0,08), което показва повишен оксидативен стрес в белите дробове в сравнение с LFD мишки (Фигура (Фигура 4А). 4 А). MPO активността обаче е относително по-ниска (P = 0,151 и 0,128; 6 и 10 DPI) при заразени HFD мишки в сравнение с LFD мишки (Фигура (Фигура 4В). 4 В). Заразените HFD мишки показват тенденция на относително по-високо генериране на NET в белите дробове при 6 DPI (P = 0,104) и 10 DPI (P = 0,111) (Фигури (Фигури 4C, D). 4 C, D). Нашите констатации съвпадат с предишни доклади, документиращи повишена неутрофилна активност при затлъстели индивиди и миши модели на DIO (14, 15, 24).

Инфектираните HFD мишки разкриват относително по-висок белодробен NETs резултат и концентрация на H2O2. (А) Концентрацията на H2O2 в белите дробове на заразени HFD мишки е сравнително по-висока при 6 DPI. Към 10 DPI концентрациите и в двете заразени групи са сходни. (Б) MPO активността в белите дробове на заразени LFD мишки е относително по-висока при 6 DPI. До 10 DPI активността на MPO обикновено е ниска както при LFD, така и при HFD групи. (° С) Представителни изображения на тройна имуномаркирана белодробна тъкан за идентифициране на NET (синьо = DAPI, зелено = хистон H2B и червено = MPO), скала = 25 μm. (Д) Белите дробове на заразени HFD мишки показват сравнително по-голямо образуване на NET в сравнение с LFD мишки както при 6, така и при 10 DPI. Стойностите представляват средните стойности ± SE на пет мишки на група (два независими експеримента). Използва се ANOVA с Tukey post hoc корекция.

Дискусия

Широкото разпространение на затлъстяването е повод за безпокойство за здравните власти в цял свят. Освен че води до редица метаболитни нарушения, като диабет тип 2 и атеросклероза, затлъстяването може да повлияе и на здравето на дихателните пътища (25). Затлъстяването ескалира чувствителността към свързаните с грип усложнения и придобитата в общността пневмония (17, 26). Докато по-ранните проучвания върху DIO и грипа са се концентрирали най-вече върху функциите на имунните клетки, като Т-клетки, макрофаги и неутрофили, досега няма съобщения за степента на NET, генерирани при затлъстели индивиди. Тъй като мрежите са замесени в много патологични състояния, тяхното значение при затлъстяване, особено по време на грипна пневмония, изисква по-голямо внимание (6, 7, 27, 28).

Въпреки че нашето проучване разкри, че и двете групи мишки BALB/c на HFD и LFD са страдали от подобна клинична прогресия по време на грипна пневмония, може да има тънки разлики в тяхната белодробна патофизиология и имунен отговор. Оценихме и сравнихме вирусния титър, концентрацията на H2O2, активността на MPO, хистопатологичната тежест и образуването на белодробни NET между двете диетични групи. Ако консумацията на HFD промени имунния отговор при мишки, това може да повлияе на вирусната репликация. По-високото белодробно вирусно натоварване може да завърши с усилена NETs стимулация поради повишени нива на провъзпалителна цитокинова сигнализация и оксидативен стрес, като се има предвид, че NETosis е окислителен процес.

В това проучване използвахме мишки BALB/c за последователност и сравнение с предишните ни модели на NET по време на грипна пневмония. Въпреки че мишките BALB/c върху HFD не се считат за строго „затлъстели“, те показват достатъчно по-голямо количество мастна тъкан, за да доведат до значителна разлика в ИТМ и телесно тегло, които също са параметри, използвани в проучвания при хора (17, 18). Други щамове на мишки (напр. C57/BL6, швейцарски мишки-албиноси) върху HFD също трябва да бъдат тествани за степента на генериране на NETs след инфлуенца. Нашето проучване разкри като цяло по-висока тенденция на белодробна НЕТоза, свързана с затлъстяване. Това предполага, че при пациенти със затлъстяване, белодробните NETs могат да се образуват на значителни нива в отговор на грипна инфекция, която може да влоши белодробното нараняване и усложненията на грипната пневмония. В заключение демонстрираме, че повишеното затлъстяване поради продължителна консумация на HFD може да доведе до относително по-голямо образуване на NET в миши бели дробове по време на тежка грипна пневмония.

Декларация за етика

Експериментите бяха извършени след получаване на одобрение за всички процедури, които трябва да се извършват върху животните, от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните, Национален университет в Сингапур (номер на протокол 050/11).

Принос на автора

AM проектира и извърши експериментите, анализира данните и написа ръкописа. SW и KT допринесоха за хистопатологично оценяване. TN допринесе за анализи на данни. VC замисля и ръководи експериментите и пише ръкописа.

Изявление за конфликт на интереси

Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови отношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.

Благодарности

Благодарни сме на M. C. Phoon, S. H. Lau и F. L. Yan за техническа помощ. Изследването е подкрепено от Националния университет в Сингапур.