1. Кристина Мюлер,
  2. Матиас Брюлмайер2,
  3. П. Август Шубигер1, 3 и
  4. Роджър Шибли1, 3
  1. 1 Център за радиофармацевтична наука ETH-PSI-USZ, Институт Paul Scherrer, Вилиген, Швейцария; 2 Отделение по нуклеарна медицина, Кантонна болница Aarau, Aarau, Швейцария; и 3 Катедра по химия и приложни биологии, ETH Цюрих, Цюрих, Швейцария
  1. За кореспонденция или препечатки се свържете с: д-р Роджър Шибли, Катедра по химия и приложни биологични науки, ETH Цюрих, 8093 Цюрих, Швейцария. Имейл: roger.schiblipharma.ethz.ch

Резюме

Ключови думи

Фолиевата киселина (FA) навлиза в клетките на бозайници или чрез повсеместно разпределения редуциран фолатен носител, или чрез ендоцитоза, улеснена от фолатния рецептор (α-FR), високоафинитетен мембранно закотвен протеин (1). Α-FR е свръхекспресиран върху голямо разнообразие от човешки тумори, включително тумори на яйчниците, ендометриума, гърдата, белите дробове, бъбреците и дебелото черво. Най-високата честота на свръхекспресия на α-FR (> 90%) е установена при карциноми на яйчниците (2,3). Експресията на α-FR, свързана с тумора, доведе до експлоатацията на FA като молекулярен „троянски кон“ за специфичното доставяне на диагностични или цитотоксични сонди в раковите клетки (4-8). Следователно, производни на фолиевата киселина, които са маркирани с подходящ радионуклид (например с 99m Tc; полуживот от 6 часа, 140 keV γ-лъчение) са подходящи за специфично и неинвазивно откриване на тумор с висока чувствителност. Наскоро фаза I и II клинични проучвания бяха завършени с радиомаркирано фолатно производно за неинвазивно откриване на α-FR-положителни бъбречни клетки и карциноми на яйчниците (9,10). В този контекст, нашата група наскоро публикува предклинична оценка на поредица от нови органометални 99m Tc-маркирани радиопроследяващи устройства за α-FR-позитивно насочване на тумор (11,12).

върху

В нормалната тъкан α-FR се експресира само в няколко органа, които участват в задържането и концентрацията на витамина, например бъбреците, хороидеалния сплит, белите дробове и плацентата. Филтрацията на фолати в бъбречните гломерули и реабсорбцията от първичната урина чрез α-FR в проксималните тубули водят до нежелано високо задържане на радиофолати в бъбречната тъкан (9,12,13). Поради това високо натрупване на радиоактивност в бъбреците, досега не можеше да се предвиди насочена туморна терапия с радиофолати, белязани с излъчващи частици изотопи, поради потенциалната нефротоксичност.

Особеност на радиофармацевтиците с ниско молекулно тегло като радиофолати е бързото им изчистване от кръвния поток. По принцип това свойство е желателно, тъй като скоро може да се постигнат високи съотношения между тумора и фона скоро след прилагането на проследяващо средство (9,13,14). От друга страна, бързото изчистване от кръвния басейн също влияе върху наличността на следи и като следствие може да доведе до ниско натрупване на тумор. Всъщност е установено, че поглъщането на тумори е ниско за различни радиомаркирани производни на фолиевата киселина (12,14).

В началото на тези проучвания ние предположихме, че повишеното регулиране или активирането на α-FR в неопластичната тъкан би повишило натрупването на радиоактивност в α-FR-положителни тумори и по този начин ще доведе до подобряване на съотношението тумор/фон. Въз основа на опитите in vitro, описани в литературата, решихме да използваме антифолатите метотрексат (MTX), ралтитрексед (RTX) и пеметрексед (PMX), за да постигнем тази цел (15,16). Антифолатите инхибират фолатно-зависимите ензими, важни за клетъчния пурин и пиримидин, както и метаболизма на аминокиселините. Ние предположихме, че раковите клетки ще реагират на антифолатно лечение и ще увеличат експресията или активирането на α-FR, за да се справят с „виртуалния” дефицит на незаменим FA. Като пряка последица, този отговор трябва да доведе до засилено натрупване на радиомаркиран фолатен следи в туморната тъкан.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Общ

(А) Химична структура на радиосигнализатора 99m Tc-PAMA-фолат (11). (Б) Химични структури на антифолати MTX, RTX и PMX. (C) Химична структура на редуцирана фолиева киселина LV.

Клетъчна култура

Клетките KB (клетъчна линия на човешки назофарингеален карцином) бяха непрекъснато култивирани като монослоеве при 37 ° С във влажна атмосфера, съдържаща 7,5% CO2. Клетките се култивират в среда FFRPMI, допълнена с 10% топлинно инактивиран фетален телешки серум (като единственият източник на фолиева киселина), 1 -глутамин и антибиотици (пеницилин при 100 IU/ml, стрептомицин при 100 μg/ml и амфотерицин В [Фунгизон] при 0,25 μg/ml).

Експерименти ин витро

На 24 часа преди всеки експеримент клетките бяха използвани за засяване на 12-ямкови плаки (8 х 105 клетки в 2 ml на гнездо), съдържащи антифолатите MTX, RTX и PMX или намалената фолатна концентрация LV при различни концентрации (0, 0,1, 1.0 и 10.0 μmol/L). След това клетките се инкубират при 37 ° С за една нощ, за да образуват сливащи се монослоеве. Супернатантите с антифолатите се отстраняват от ямките и клетъчните монослоеве се изплакват два пъти с ледено студен PBS (рН 7.4). Чиста FFRPMI среда (без фетален телешки серум, 1 -глутамин и антибиотици; 975 μL) се добавя към всяка ямка. Плаките бяха предварително инкубирани при 37 ° С в продължение на 10 минути. Добавя се разтвор на 99m Tc-PAMA-фолат (25 μL, 1 MBq/mL) и плаките се инкубират при 37 ° С за 1 h. След това супернатантите се отстраняват и монослоевете се промиват с ледено студен PBS. За да се определи интернализираната фракция, клетъчните проби се измиват с киселинен буфер за отстраняване (воден разтвор на оцетна киселина при 0,1 mol/L и NaCl при 0,15 mol/L; рН 3) (17). Проведени са проучвания на α-FR блокада, както е съобщено по-рано с добавяне на FA (100 μmol/L) (12). Монослоевете се лизират в 1N NaOH (1 ml) и се прехвърлят в епруветки от 4 ml и се получава броя на радиоактивността с γ-брояч (Таблица 1).

In vitro клетъчно свързване и интернализация (Процент от общата добавена радиоактивност) на Radiotracer 99m Tc-PAMA-фолат в култивирани KB клетки, предварително обработени с MTX, RTX, PMX и LV *

In Vivo експерименти

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ИЗСЛЕДВАНЕ SPECT

Експериментите с образи бяха проведени чрез използване на X-SPECT система (Gamma Medica Inc.) с SPECT и CT устройство с една глава 24 часа след инжектирането на 99m Tc-PAMA-фолат (200 μL, 450-600 MBq). След това мишките се анестезират със смес изофлуран: кислород. Дълбочината на анестезията се проследява чрез измерване на дихателната честота. Телесната температура се контролира от ректална сонда и се поддържа при 37 ° С с нагрята въздушна струя. Времето за сканиране варира между 30 и 60 минути. Данните за SPECT бяха получени и реконструирани със софтуера LumaGEM (версия 5.407; Gamma Medica). CT данните бяха получени с рентгенова CT система (Gamma Medica) и реконструирани със софтуер Cobra (версия 4.5.1; Exxim-Computing Corporation). Обединяването на SPECT данни и CT данни е извършено със софтуера IDL Virtual Machine (версия 6.0; ITT Visual Information Solutions).

РЕЗУЛТАТИ

In vitro ефект на антифолатите и LV върху клетъчното усвояване на 99m Tc-PAMA-фолат

За експериментите in vitro, KB клетките бяха изложени на различни концентрации на антифолатите MTX, RTX и PMX и намалената фолатна концентрация LV в продължение на 24 часа преди добавянето на 99m Tc-PAMA-фолат. Клетъчното усвояване на 99m Tc-PAMA-фолат се увеличава с увеличаване на дозите на антифолатите (Таблица 1). В клетъчни проби, предварително инкубирани с най-високата концентрация на антифолати (10 μmol/L), 65% –80% от общата добавена радиоактивност е специфично свързана с клетките; 25% -35% е установено, че клетката е свързана в необработени контролни проби. Вътрешната фракция на радиосигнализатора също се увеличава в предварително обработени с антифолати клетки (19% -27% срещу 5% -10% в контролните проби). В клетъчни проби, инкубирани с LV при концентрации от 0,1 и 1 μmol/L, усвояването на 99m Tc-PAMA-фолат е сравним с този в контролните проби; е установено намаляване с около 50% от общата свързана с клетките радиоактивност и интернализация при концентрация от 10 μmol/L (Таблица 1).

In Vivo ефект на антифолатите и LV върху биоразпределението на 99m Tc-PAMA-фолат

Ефект на антифолат MTX, администриран чрез питейна вода.

Данни за биоразпределение за Radiotracer 99m Tc-PAMA-фолат при атимични голи мишки, носещи KB ксенографти и предварително инжектирани с MTX, RTX и PMX 1 час преди приложението на Radiotracer *

Радиоактивност (% ID/g) в тумор (A) и бъбреци (B) и съотношение тумор към бъбреци (C) като функция от времето на предварително администриране на MTX, RTX и PMX. (Подробни данни са дадени в допълнителен материал.)

Времева зависимост на биоразпределението на 99m Tc-PAMA-фолат в отговор на антифолати.

Ефект от интравенозно администриран LV.

LV интравенозно се инжектира 1 час преди радиотрасера ​​да доведе до почти пълна блокада на туморно и бъбречно натрупване на 99m Tc-PAMA-фолат (0,20 ± 0,04% ID/g за тумор [P 99m Tc-PAMA-фолат при анестезиран туморен лагер мишки с помощта на специален скенер SPECT/CT за малки животни (фиг. 3). По това време радиопроследяващият механизъм се е изчистил от повечето органи и тъкани, с изключение на тези, експресиращи α-FR. Мишките са получили антифолатния PMX интравенозно 1 час преди радиопроследяващия (фиг. 3В) или само радиопроследяващия (фиг. 3А). Α-FR – положителният тумор и бъбреците бяха лесно визуализирани в 99m Tc-PAMA-фолатни SPECT изображения на мишка А (фиг. 3А) като има предвид, че мишка B показа очаквания спад в бъбречното натрупване на 99m Tc-PAMA-фолат, когато антифолатът беше предварително инжектиран (фиг. 3B). Допълнителни SPECT/CT изображения с висока разделителна способност на мишки с и без инжектиране на PMX 99m Tc-PAMA -фолат са представени на допълнителни фигури 2 и 3.

(A) Скица на in vivo образна процедура с 99m Tc-PAMA-фолат и коронални SPECT/CT секции (24 часа след инжектиране на 99m Tc-PAMA-фолат) на нива на тумори и бъбреци на мишки с подкожна α-FR-положителна KB тумори, но без преинжекция на PMX. (Б) Процедура с предварително инжектиране на PMX и съответните коронални SPECT/CT секции. i.v. = интравенозно.

Допълнително видео 1 показва SPECT/CT проекции на мишка с PMX и 99m Tc-PAMA-фолат. Сканиранията са взети 24 часа след инжектирането на радиопроследяващия апарат. Използван е високочувствителен колиматор с паралелни отвори. Продължителността на сканирането е между 30 и 60 минути.

Допълнително видео 2 показва SPECT/CT проекции на мишка без PMX, но само 99 m Tc-PAMA-фолат. Сканиранията са взети 24 часа след инжектирането на радиопроследяващия апарат. Използван е високочувствителен колиматор с паралелни отвори. Продължителността на сканирането е между 30 и 60 минути.

ДИСКУСИЯ

Съотношението тумор/бъбрек обикновено е ниско за всички докладвани радиофолати поради неблагоприятно високото натрупване в α-FR-положителна бъбречна тъкан (23,24) и едновременно ниското поемане на тумора. Следователно, подобрението по отношение на двете, регулиране на поемането на тумори или понижаване на задържането на бъбреците е важно, особено по отношение на потенциалната туморна терапия с FA, свързана с радионуклиди, излъчващи частици.

В началото на настоящото проучване изглеждаше малко вероятно селективната блокада на поглъщане на радиофолати в α-FR-положителните бъбреци да бъде постигната без съпътстващо инхибиране на туморното поемане. Следователно, ние се стремим да увеличим поемането на тумор на 99m Tc-PAMA-фолат чрез повишаване на експресията на α-FR в злокачествени клетки. Експресията на α-FR или активността на FR-медиирания транспорт се регулира от извънклетъчни и вътреклетъчни концентрации на фолат (25,26). По-рано беше показано, че лечението с антифолати води до повишаване на експресията на α-FR в клетъчни култури на НТ-29 поради интерференция на антифолатите с метаболизма на фолатите (15). По този начин предположихме, че предварителната обработка на антифолати на мишки, носещи тумор, може също да стимулира експресията на α-FR in vivo и да засили туморното натрупване на 99m Tc-PAMA-фолат.

Нашите in vitro данни, получени с α-FR-положителни KB клетки, изложени на MTX, RTX и PMX, бяха в съответствие с наблюденията, съобщени за клетки HT-29. Преинкубацията на KB клетки с антифолати повишава клетъчното поемане на радиопроследяващия с фактор 2. Забележително е, че ефектът е почти идентичен за всички антифолати, въпреки че те са насочени към различни ензими и имат различен афинитет към α-FR (27, 28). Също така включихме в нашите проучвания LV, което обръща цитотоксичността на лечението с MTX на ниво дихидрофолат редуктаза (29). За разлика от антифолатите, LV намалява поглъщането на радиосигналите в туморните клетки, което е в съгласие с наблюденията, публикувани в литературата (30).

Тъй като предварителното инжектиране на MTX, RTX и PMX само 1 час преди прилагането на 99m Tc-PAMA-фолат е малко вероятно да стимулира α-FR повишаване на регулацията при тумори (идея, подкрепена от нашите ин витро експерименти; допълнителна таблица 3), въпросът възникна като до това дали подобрените съотношения на тумора към бъбреците също могат да бъдат постигнати с нетоксична LV. Подобно на MTX, LV показва висок афинитет към намаления фолатен носител, но се свързва със значително по-нисък афинитет към α-FR от FA (28,30). Установихме обаче, че предварително инжектираната ЛН почти напълно блокира както поемането на тумора, така и поглъщането на 99m Tc-PAMA-фолат в бъбреците (допълнителна таблица 2) толкова ефективно, колкото FA (12). Трябва да се отбележи, че предварителното прилагане на антифолати или LV засяга изключително поглъщането на радиофолати в бъбреците и туморите и не е оказало ефект върху радиопроследяващите, които не са насочени към α-FR (данни за биоразпределение in vivo на 99m Tc-PAMA-витамин В12 допълнителния материал; за структурата на 99m Tc-PAMA-витамин В12, вижте допълнителна фигура 1).

Резултатите от SPECT проучвания, проведени с 99m Tc-PAMA-фолат при тумор-носещи мишки, със и без предварително инжектиране на PMX, са успоредни на данните след смъртта. При контролните мишки радиоактивността в бъбреците доминира в натрупването на тумор; за разлика от тях, сканирането с SPECT разкри практически пълно отсъствие на радиоактивност в бъбреците на мишки, инжектирани с PMX. Радиоактивността в други органи, като черния дроб и белите дробове, не се открива и само остатъчни следи от радиоактивност се наблюдават в стомашно-чревния тракт 24 часа след инжектирането.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предварителното приложение на антифолатите MTX, RTX и PMX селективно потиска усвояването на 99m Tc-PAMA-фолат в α-FR-положителните бъбреци, докато приемането в α-FR-положителна неопластична тъкан остава почти непроменено. Нашите данни предоставят сериозни доказателства, че тези подобрения могат да бъдат постигнати с произволно маркирано производно на фолиева киселина, когато се комбинира с антифолат. Тези резултати отварят нови перспективи за диагностика на тумори с радиофолати и по-специално за потенциалното лечение на пациенти с рак с комбинация от антифолатни химиотерапевтици и радиофолати, маркирани с изотоп, излъчващ частици.

Благодарности

Благодарим на Робърт Вайбел, Александър Хон, Джудит Щел и Кристин Де Паскуале за техническата помощ. Тази работа беше финансово подкрепена от Mallinckrodt-Tyco Inc. и Merck Eprova AG.

Бележки под линия