Кореспонденция на: д-р Минг-Лианг Ченг, Катедра по инфекциозни болести, Медицински колеж Гуиянг, Гуиянг 550004, провинция Гуйджоу, Китай. moc.nc12@lmgnehc

Телефон: + 86-851-6752795 Факс: + 86-851-6741623

Резюме

ЦЕЛ: Да се ​​изследват ефектите на боровинката върху чернодробната фиброза и свързания с NF-E2 фактор 2 (Nrf2) транскрипционен фактор при плъхове.

МЕТОДИ: Четиридесет и пет мъжки плъха Sprague-Dawley бяха разделени на случаен принцип в контролна група (A); CCl4-индуцирана група на чернодробна фиброза (B); група за превенция на боровинки (С); Група за превенция на капсулата Dan-shao-hua-xian (DSHX) (D); и група за превенция на боровинки + DSHX (E). Чернодробна фиброза се предизвиква при плъхове чрез подкожно инжектиране на CCl4 и диета с високо съдържание на липиди/ниско протеини в продължение на 8 седмици (с изключение на контролната група). Изследвано е нивото на хиалуронова киселина (HA) и аланин аминотрансфераза (ALT) в серума. Определя се активността на супероксиддисмутаза (SOD), глутатион-S-трансфераза (GST) и малондиалдехид (MDA) в чернодробните хомогенати. Степента на чернодробна фиброза е оценена чрез оцветяване с хематоксилин и еозин и Masson. Експресията на Nrf2 и NADPH хинон оксидоредуктаза 1 (Nqo1) беше открита чрез обърната в реално време транскрибирана полимеразна верижна реакция, имунохистохимични техники и уестърн блотинг.

РЕЗУЛТАТИ: В сравнение с група В, чернодробните индекси, нивата на серумен HA и ALT на групи C, D и E са намалени (чернодробни индекси: 0,038 ± 0,008, 0,036 ± 0,007, 0,036 ± 0,005 срещу 0,054 ± 0,009, P Ключови думи: Боровинка, чернодробна фиброза, фактор 2, свързан с NF-E2, NADPH хинон оксидоредуктаза 1, глутатион-S-трансфераза

ВЪВЕДЕНИЕ

Чернодробната фиброза е често срещан резултат от хронично увреждане на черния дроб [1]. Оксидативният стрес напоследък е признат за основен фактор в патологичните промени, наблюдавани при различни чернодробни заболявания [2,3]. Оксидативният стрес може да причини прекомерно увреждане на хепатоцитите чрез липидна пероксидация и протеиново алкилиране [4,5]. Свързаният с NF-E2 фактор 2 (Nrf2) е важен транскрипционен фактор, който регулира антиоксидантните стресови реакции. NADPH хинон оксидоредуктаза 1 (Nqo1) и глутатион-S-трансфераза (GST) са основните ензими за детоксикация фаза II, контролирани от Nrf2 [6,7].

Боровинките са цъфтящи растения, които принадлежат към Vaccinium spp. от семейство Ericaceae. Изследователският център за човешко хранене (Mayer, САЩ) е извършил поредица от интензивни изследвания на боровинките. Тези проучвания показват, че боровинките съдържат антоцианини, полифеноли и флавоноиди и изглежда имат най-високата антиоксидантна способност сред обикновените плодове и зеленчуци [8,9]. Боровинките могат да повлияят и на хронични заболявания чрез противовъзпалителни и противотуморни механизми [10,11].

Фокусът на настоящото проучване беше да се изследва ефектът на боровинката върху чернодробната фиброза и ензимните системи за детоксикация при плъхове.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Етично одобрение на протокола за изследване

Всички проучвания върху животни са били в съответствие с Насоките за грижи и употреба на животните на Медицинския колеж Guiyang (Guiyang, Китай).

Реактиви и третиране на животни

Четиридесет и пет мъжки плъхове Sprague-Dawley (200 ± 20 g) са получени от Експерименталния център за животни на Медицински колеж Гуиянг [Номер на одобрение SCXK (Guizhou) 2002-0001]. Плъховете бяха разделени на случаен принцип в пет групи от по девет: контролна група (A); CCl4-индуцирана група на чернодробна фиброза (B); група за превенция на боровинки (С); Група за превенция на капсулата Dan-shao-hua-xian (DSHX) (D); и боровинки + група за предотвратяване на DSHX (E).

Освен в контролната група, чернодробната фиброза се индуцира във всяка група чрез сложен метод [12]. Плъховете в групи В-Е получават подкожни инжекции от 40% разтвор на CCl4 (смес от чист CCl4 и фъстъчено масло) и 0,3 ml/100 g два пъти седмично в продължение на 8 седмици (първата доза е 40% CCl4 0,4 ​​ml/100 g). Плъховете са хранени с високо липидна/нискобелтъчна диета (79,5% царевична фарина, 20% мазнини и 0,5% холестерол) всеки ден. Плъховете от група А са били хранени само с нормална диета. В същото време се преработва сок от боровинки (1,5 g/100 g на ден, перорално, „Rabbiteye Blueberry“; поле за производство на боровинки в Ma-Jiang, Гуейджоу, Китай). Пробите се съхраняват при -20 ° C до употреба и се хомогенизират, за да се приготви сок от боровинки (1 ml сок от боровинки съдържа около 2 g сушени боровинки). DSHX (1,0 g/kg на ден, перо; номер на партида 20081011; DSHX капсули, съставени от пет китайски билкови лекарства, Tetrandrine, Radix Salviae Miltiorrhizae, Radix Paeoniae Rubra, Astragalus Membranaceus и Ginkgo leaf; Guiyang Pharmaceutical Company, Guizhou, China) и боровинка сок + DSHX (1,5 g/100 g + 1,0 g/kg, перорално, дневно) се дават на плъхове в групи CE. След 8 седмици имаше осем оцелели в групи A, B, D и E и девет в група C.

Плъховете бяха убити, за да събират кръв и черен дроб (плъховете бяха претеглени преди убиването). Мокрият черен дроб беше претеглен. Същата част от всеки черен дроб беше отстранена и фиксирана в 10% неутрален формалин; останалата част от черния дроб се съхранява при -80 ° C до употреба. Плъхов серум се центрофугира (1500 r/min за 15 минути при стайна температура) и се съхранява при -80 ° C до употреба.

Хистопатология

След фиксиране в 10% формалин за 24 часа, пробите се влагат в парафин. След това пробите се нарязват на парчета от 5 μm и се монтират върху предметни стъкла. Те бяха оцветени с хематоксилин и еозин (HE) за хистопатологично изследване и със специфично за фиброза оцветяване на Masson за оценка на степента на чернодробна фиброза [13].

Изчисляване на индекса на черния дроб

Чернодробният индекс се изчислява по формулата [12]: (тегло на черния дроб/тегло на плъх) × 100%.

Измерване на нивата на хиалуронова киселина и аланин аминотрансфераза

Концентрациите на хиалуронова киселина (HA) (номер на партида 20090501, Шанхайски институт по морска медицина, Шанхай, Китай) и аланин аминотрансфераза (ALT) бяха измерени чрез радиоимуноанализ (RIA) или чрез автоматичен биохимичен аналитичен инструмент (Siemens Advia 1650, Bensheim, Германия ).

Измерване на нивата на супероксиддисмутаза, глутатион-S-трансфераза и малондиалдехид в чернодробните хомогенати

Бяха приготвени чернодробни хомогенати. Съдържанието на супероксиддисмутаза (SOD) се определя по метода на ксантиноксидазата; съдържанието на малондиалдехид (MDA) беше тествано по метода на тиобарбитуровата киселина; и GST съдържание, изследвано по метода на комбинацията на динитробензол, съгласно инструкциите на производителя (съответно номера на партиди 20090521, 20090522 и 20090522; Jiancheng Biologic Co., Nanjing, Китай).

Анализи на верижна реакция с обратна транскриптаза-полимераза в реално време

Общата РНК се екстрахира от чернодробни тъкани с реактив Trizol (партиден номер 13827390; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и се пречиства. Това беше последвано от обратна транскрипция (номер на партида 00033699; Fermentas, MBI, Burlington, ON, Канада) с обратна транскриптаза на Moloney миши левкемия (MMuLV) и олиго (dT) 18 праймери. праймери за полимеразна верижна реакция (PCR) са доставени от д-р Jie Liu (Американски национален институт по рака към Националния институт по екологични здравни науки (NC, САЩ) (Таблица (Таблица 1). 1). SYBR Зелена ДНК PCR комплект (партида номер 0804104; Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ) е използван за анализи в реално време с обратна транскриптаза (RT) -PCR. Стойностите на времето на цикъла (Ct) на гените, които представляват интерес, са нормализирани за първи път с β-актин от същия относителна разлика между групите, изчислена и изразена като относително увеличение, определяща контрола като 100%.

маса 1

Последователности на праймера за RT-PCR анализи в реално време

ГениGenBank
БройНапредОбратен
β-актин > V01217TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA
Nrf2 > NM_057152CCATGCCTTCTTCCACGAAAGGGCCCATGGATTTCAGTT
Nqo1 > NM_017000CCAATCCTCCACCCACTTGTGTCCCTCAGCCATTGTTTGAG

RT-PCR: Обратна транскриптаза-полимеразна верижна реакция.

Имунохистохимичен анализ

След депарафинизация, рехидратация и демаскиране на антиген чрез топлинна обработка, хистологичните срезове се поставят в 3% H2O2 за 10 минути. След това те бяха инкубирани с анти-Nrf2 (партиден номер K2008; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) и anti-Nqo1 (партиден номер B1508; Santa Cruz Biotechnology) антитяло (1: 100) за една нощ при 4 ° C. След това пробите бяха обработени с помощта на комплект EnVision (номер на партида 10N1775A; Dako, Дания) съгласно протоколите на производителя. PBS беше използван като отрицателна контрола. Жълтият материал в цитолимфата/ядрото се счита за положителна клетка. Пет микроскопични полета (увеличение от 400 пъти) бяха избрани на случаен принцип за парче и броят на клетките на поле беше преброен.

Уестърн блотинг

Общият протеин и цитоплазмата бяха извлечени по метода на Брадфорд, количествено измерван с помощта на комплекти (номера на партиди 090310 и 090401; Институт за биологично инженерство в Нанкин Кайджи, Пекин, Китай). Четиридесет микрограма общ екстракт (Nrf2)/екстракт от цитоплазма (Nqo1) се варят в равен обем от 2 × SDS пробен буфер за електрофореза в продължение на 5 минути преди 12% SDS-PAGE. След електрофореза, протеините бяха прехвърлени в мембрани от поливинилиден флуорид (партиден номер K7KN9080G; Millipore, Billerica, МА, САЩ). Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено сухо мляко-TBST буфер за 1 h при стайна температура и след това измити в TBST буфер. Мембраните се инкубират с 1: 1000 разреждане на първично антитяло от Nrf2 и Nqo1 за една нощ. На втория ден мембраните се измиват, последвано от инкубация с 1: 5000 разреждане на хрян пероксидазно вторично антитяло (партидни номера D2409 и G1009; Santa Cruz Biotechnology) за 1 h. Прехвърлените протеини се визуализират с комплект за откриване на електрохимилуминесценция (партиден номер 09065A2; Millipore) и кратко излагане на мембраната на рентгенови филми. β-актин (номер на партида 028K4826; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) е използван като вътрешна справка.

Статистически анализ

Таблица 2

Чернодробен индекс, серумен HA, ALT и SOD, MDA, GST на чернодробния хомогенат в различни групи (средно ± SD)

ГрупанЧернодробен индекс (относително тегло на черния дроб)HA (ng/ml)ALT (U/L)SOD (μ/mg)MDA (nmol/mg)GST (μ/mg)
A80,03 ± 0,000351,75 ± 125,1657,25 ± 6,881,76 ± 0,340,206 ± 0,0525,95 ± 1,97
Б.80,054 ± 0,009 a 828,50 ± 237,83 a 203,25 ± 31,62 a 1,08 ± 0,19 a 0,335 ± 0,056 a 7,30 ± 1,26 a
° С90,038 ± 0,008 c 502,33 ± 110,57 c 149,44 ± 16,51 a c 1,36 ± 0,09 c 0,294 ± 0,026 a c 7,37 ± 0,87 a
д80,036 ± 0,007 c 524,25 ± 255,42 c 136,88 ± 10,07 a c 1,42 ± 0,13 c 0,285 ± 0,025 a c 7,35 ± 0,88 a
Е.80,036 ± 0,005 c 499,25 ± 198,10 c 127,38 ± 11,03 a c 1,50 ± 0,15 c 0,284 ± 0,028 a c 7,81 ± 1,16 a

ефекти

Чернодробна тъкан във всяка група плъхове (HE оцветяване, увеличение 40 ×). A: Светлинна микроскопия, показваща нормална чернодробна тъкан в контролната група; B: Отбелязана фиброза в моделната група; C-E: Патологичната промяна в лекуваната група е по-лека в сравнение с тази в моделната група.

Таблица 3

Степен на чернодробна фиброза при всяка група плъхове