Affiliations Inserm U693, Le Kremlin-Bicêtre, Франция, Université Paris-Sud, Faculté de Médecine Paris-Sud, UMR-S693, Le Kremlin-Bicêtre, Франция

ефекти

Принадлежност Еврейският университет в Йерусалим, Институт по биохимия, хранителни науки и хранене, Реховот, Израел

Принадлежност Еврейският университет в Йерусалим, Институт по биохимия, хранителни науки и хранене, Реховот, Израел

Affiliations Inserm U693, Le Kremlin-Bicêtre, France, Université Paris-Sud, Faculté de Médecine Paris-Sud, UMR-S693, Le Kremlin-Bicêtre, France, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Hôpital de Bicêtre, Service d'Endocrinologie des Maladies de la Reproduction, Le Kremlin Bicêtre, Франция

  • Надеж Каре,
  • Гили Соломон,
  • Arieh Gertler,
  • Надин Бинарт

Фигури

Резюме

Цитат: Carré N, Solomon G, Gertler A, Binart N (2014) Ефекти на високо афинитетния лептинов антагонист върху мъжка мишка с дефицит на рецептор на пролактин. PLoS ONE 9 (3): e91422. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091422

Редактор: Джули А. Чоуен, Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, CIBEROBN, Испания

Получено: 13 декември 2013 г .; Прието: 11 февруари 2014 г .; Публикувано: 25 март 2014 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Agence Nationale de la Recherche (09-BLAN-0246), Национален институт на Санте и де ла Recherche Médicale, Université Paris-Sud. N.B. е удостоен с договор за Институт за национален де ла Санте и де ла Речерче Медицина-Асистент Publique-Hôpitaux de Paris. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Наскоро показахме, че липсата на PRLR причинява резистентност към затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, поради повишен разход на енергия и повишена скорост на метаболизма. Мутантните мишки показват намалена мастна маса, свързана с появата на масивни кафяви адипоцитни огнища в мастните депа при диета с високо съдържание на мазнини [11]. Тъй като тези животни имат променен прием на храна, нашата цел беше да се тества дали лептинът оказва влияние върху тяхното хранително поведение. За тази цел използвахме наскоро разработения монопегилиран супер активен миши лептинов антагонист (D23L/L39A/D40A/F41A мутант на миши лептин), наречен PEG-SMLA [12] и третирахме подгрупите както на контролни, така и на PRLR мишки с дефицит подобряване на ендогенното сигнализиране за лептин. Наскоро показахме, че костните анализи показват значително увеличение на трабекуларните и кортикалните параметри, измерени както в лумбалните прешлени, така и в пищялите, при третирани с PEG-SMLA мишки през първия и третия месец, както и значително увеличение на биомеханичните параметри на пищяла [ 13]. В това проучване проверихме дали подобен ефект на PEG-SMLA се проявява и при мишки с дефицит на PRLR.

Материали и методи

Декларация за етика

Във всички експерименти животните се поддържат в рамките на 12-часови цикли светлина/тъмнина и се отглеждат съгласно Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни, публикувано от Националния здравен институт на САЩ (NIH Publication No. 85-23, ревизирана 1996 г. ). Съоръжението за животни е получило одобрение (N ° C94-043-12), дадено от френската администрация (Ministère de l’Agriculture). Всички процедури бяха одобрени от местния етичен комитет Consortium des Animaleries Paris Sud (CAPSud) (N ° 2012-021).

Животни и лечение

Седемседмични мъжки мишки 129/SvJ мишки див тип или PRLR -/- са получени в нашата местна колония със свободен достъп до храна и вода. PEG-SMLA се приготвя, както е описано от Shpilman et al [12]. Мишките се прилагат подкожно с PEG-SMLA при 12 mg/kg през ден за период от 20 дни. През този период приемът на храна и наддаването на тегло се записват ежедневно и се осредняват за период от 7 дни. Мишките бяха убити след интраперитонеална анестезия (смес от кетамин/ксилазин) и депата на мастната тъкан бяха претеглени и замразени в сух лед.

Изолиране на обща иРНК и анализ чрез qRT-PCR

Общата РНК беше извлечена от мастните тъкани, използвайки разтвор на реагент TRI (Life Technologies, Saint-Aubin, Франция) чрез хомогенизиране с Tissuelyser (Qiagen, Courtaboeuf, Франция). Количествена PCR в реално време се извършва, както е описано по-горе [14]. След третиране с ДНКаза I, РНК се транскрибира обратно и се използва за количествена RT-PCR (qRT-PCR), използвайки Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Франция). Крайните концентрации на праймера бяха 300 nM (последователностите на праймерите са достъпни при поискване). Реакционните параметри бяха проведени на PCR система в реално време на StepOne ™ (Applied Biosystems). Относителната експресия на Leptin, Zfp423, PPARγ и aP2 гени в дадена проба се изчислява като съотношение (амол на специфичен ген/амол от 36B4). Резултатите са представени като средна стойност ± SEM.

Истоморфологични процедури

Мастните тъкани се фиксират за една нощ в 4% параформалдехид във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), дехидратират се в 70% етанол и се влагат в парафин. Бяха подготвени срезове с дебелина пет μm и анализирани вградени в парафин мастни раздели след оцветяване с хематоксилин и еозин. Шест полета бяха наблюдавани на случаен принцип при увеличение × 10 на оптичния микроскоп (Provis, Olympus, Rungis, Франция). Количественото определяне на размера на адипоцитите беше извършено с помощта на софтуера ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) върху поне> 200 клетки на мишка, което доведе до средно определяне на повърхността на адипоцитите върху 5000 до 8000 адипоцити на генотип.

Аналитични процедури

Серумните концентрации на триглицериди (TG), холестерол (CH), неестерифицирани мастни киселини (NEFA), аланин-аминотрансфераза (ALAT) и аспартат аминотрансфераза (ASAT) бяха определени с помощта на автоматизирано устройство на Monarch (Laboratoire de Biochimie, Faculté de Médecine Bichat, Париж, Франция). Концентрациите на серумен инсулин се определят с помощта на ултра-чувствителен миши инсулин ELISA (Crystal Chem, Downers Grove, IL, САЩ) и миши инсулин ELISA (Mercodia, Uppsala, Швеция), като се използва миши инсулинов стандарт, обхватът на анализа е 0,1-6,4 ng/ml и 0,2–6,5 ng/ml съответно.

Тестове за орална толерантност към глюкоза (OGTT)

Тестовете за толерантност към глюкоза са проведени 12 дни след началото на лечението чрез глюкозен сондаж (2 g D-глюкоза/kg телесно тегло) след гладуване през нощта. Глюкозата в кръвта се определя с помощта на AccuCheck performa глюкомер (Roche). Кръвни проби бяха събрани преди и на 30, 45, 60, 90 и 120 минути след сондата.

Определяне на хомеостатичен модел (HOMA)

Инсулиновата резистентност се оценява чрез използване на HOMA-IR, както следва: плазмена глюкоза на гладно (mg/dl) × инсулин на гладно (mU/l)/405.

Микрокомпютърна томография (КТ) Анализ на трабекуларни кости

Извършен е микро-КТ анализ на трети и четвърти лумбални прешлени (LV), както е описано наскоро [13]. Трабекуларните костни измервания в лумбалния прешлен включват трабекуларен костен обем (BV)/обем на тъканите (TV) (%), трабекуларен номер (Tb.N) (1/μm), трабекуларна дебелина (Tb-Th) (μm) и трабекуларен разделяне (Tb.Sp) (μm).

Статистически анализ

Данните се изразяват като средни стойности ± SEM и се анализират с помощта на двупосочен ANOVA тест с използване на компютърния софтуер Prism 5 (GraphPad Software, Сан Диего, САЩ). Статистическата значимост е посочена при p стойности -/- Мишки

За да се обърне внимание на ролята на лептина в модел на мишка с дефицит на PRL рецептор, който е устойчив на индуцирано от диетата наддаване на тегло, ние изследвахме ефекта на PEG-SMLA върху енергийната хомеостаза в сравнение с WT мишки. Определени са ефектите от лечението върху наддаването на тегло, приема на храна, морфологията и развитието на мастната тъкан и енергийната хомеостаза.

Лечението с PEG-SMLA предизвиква бързо и драстично увеличаване на теглото от почти същия ред (20%) при WT и PRLR -/- мишки, както е показано на фигури 1А и 1В. PRLR -/- мишките показаха базално телесно тегло по-ниско от това на мишки от див тип [15], но третирането с PEG-SMLA предизвика подобно високо значимо (p -/- третирани мишки (Фигура 1А), което беше количествено определено на Фигура 1В. По време на първата седмица от лечението, промяната на телесната маса на инжектираните мишки се е увеличила с около 20%, докато тази на контролните мишки не се е променила с повече от 3% (Фигура 1Б). присъствието на PRLR, представлява драстично статистически значимо увеличение на техния прием на храна в сравнение с мишки, инжектирани с физиологичен разтвор през първата седмица от лечението (Фигура 2А) .Повишаването на телесното тегло и приема на храна на третирани с PEG-SMLA мишки през втората седмица са по-малко от тези на нетретираните мишки (Фигура 2А). Важно е да се отбележи, че третирането с PEG-SMLA показва обратими ефекти и когато лечението е спряно, телесното тегло на бивши третирани с PEG-SMLA мишки намалява до стойностите на контролирайте мишки в рамките на 10 дни (данните не са показани). След 20 дни лечение, дисекцията разкрива, че увеличената мастна маса при третирани с PEG-SMLA мишки е по-слабо изразена при PRLR -/-, отколкото при WT мишки (Фигура 2В).

(А) Представителен гръбен изглед на мъжки мишки след 20 дни инжекции с физиологичен разтвор (контрол) или PEG-SMLA. (B) Сравнение на ефектите на PEG-SMLA върху наддаването на тегло на WT (отворени квадратчета) или PRLR -/- (черни квадратчета) мъжки мишки. PEG-SMLA се инжектира ежедневно при 6 mg/kg. ***, p Фигура 2. Ефекти от лечението с PEG-SMLA върху приема на храна и масата на мастните тъкани.

(A) Консумацията на храна (g) се изчислява според телесното тегло на всяка мишка през първата или втората седмица от лечението. Инжекциите с PEG-SMLA са представени в рамките на излюпени ленти. b, p -/- третирани мишки показаха по-малки подложки с бяла мазнина от тези на третирани с WT PEG-SMLA животни (Фигура 2С). Това показва, че PRLR -/- мишките са реагирали на лептиновия антагонист чрез увеличаване на приема на храна само със значително увеличение на депото на мастна жлеза без промени в други мастни депа.

Анализ на генната експресия на адипозни маркери и морфология на адипоцитите

След това изследвахме експресията на специфични маркерни гени на мастната тъкан. Увеличаването на мастната тъкан се отразява чрез значително по-висока експресия на лептин в гонадни и ингвинални мастни тъкани след лечение с лептин-антагонист независимо от генотипа на животните (Фигура 3А).

(A – D) Експресията на лептин, Zfp423, PPAR и aP2 гена се определя количествено чрез qPCR във всяка гонадна, около бъбречна, ингвинална мастна депо на WT и PRLR -/- нетретирани мишки (Контрол) и третирани животни (PEG-SMLA, излюпени решетки) съответно (n = 5-8/група) b, p -/- (Контрол) и третирани животни (PEG-SMLA, излюпени решетки). Извършен е статистически анализ. b, p 2). При нелекувани животни от двата генотипа, 40% от адипоцитите са имали повърхност по-ниска от 500 μm 2, докато те представляват само 30% след третиране с PEG-SMLA в WT, но не и при PRLR -/- мишки. Както се очакваше, адипоцитите на WT животни, получаващи PEG-SMLA лечение, бяха хипертрофични в сравнение с тези на контролните мишки (адипоцити по-големи от 2000 μm 2). Статистическият анализ на повече от 5000 независими определяния показва, че ингвиналните мастни депа от PRLR -/- мишки показват същия дял на малки адипоцити в сравнение с тези на WT мишки. При третиране с PEG-SMLA, ние забелязахме, че третирани с PRLR -/- мишки показват същото разпределение на размера на адипоцитите в мастната тъкан и на двата генотипа на нетретирани животни. Увеличаването на размера на адипоцитите изглежда е резултат от третиране с PEG-SMLA само на WT мишки, така че това лечение не успя да промени разпределението на размера на адипоцитите при PRLR -/- мишки.

Развитие на непоносимост към глюкоза след лечение с антагонисти

За да определим дали лечението с PEG-SMLA влияе върху хомеостазата на глюкозата, направихме орален тест за толерантност към глюкоза (OGTT). Десет седмични WT и PRLR -/- мишки, инжектирани с лептинов антагонист, показват хипергликемия на гладно (Фигура 4А) в сравнение с контролни инжектирани с физиологичен разтвор мишки. Това предполага нарушение на глюкозния толеранс, потвърдено от OGTT, показано на фигура 4В. Концентрацията на инсулин в плазмата се определя на гладно и 30 минути след измерване на глюкозата. Мишките, лекувани с PEG-SMLA, имат по-високи нива на инсулин както в 0, така и в 30 минути в сравнение с нетретираните мишки (Фигура 4С). Изчисленият индекс HOMA-IR се усилва до голяма степен при третирани животни, като осигурява допълнителна подкрепа за нарушена инсулинова чувствителност (Фигура 4D).

(А) Гликемия на гладно при мишки, третирани с физиологичен разтвор и третирани с PEG-SMLA. b, * p -/- мишки третирани с PEG-SMLA или не. (C) Гладуване (ляв панел) и 30 минути след измерване на глюкоза (десен панел) плазмени нива на инсулин. (D) HOMA-IR индекс, отразяващ инсулиновата резистентност, се изчислява, както следва: плазмена глюкоза на гладно (mg/dl) × инсулин на гладно (mU/L)/405.

Метаболитни параметри при мишки, лекувани от лептинов антагонист

Инжектирането на лептинов антагонист не индуцира промяна в нивата на трансаминазите (ALAT и ASAT), което показва непроменена чернодробна функция (Таблица 1). Проучен е и липидният серумен профил, за да се оценят промените в мастните тъкани. Леко намаляване на концентрациите на неестерифицирани мастни киселини (NEFA) се наблюдава при контролни условия само при PRLR -/- мишки поради потенциалното използване на мускулите или намалената липолиза. Тези концентрации на NEFA обаче не са модифицирани при третирани с PEG-SMLA животни от двата генотипа (Таблица 1), което предполага, че активността на липолизата на мастната тъкан не се променя след лечението. Въпреки това, инжектирането на PEG-SMLA индуцира ясно повишаване на циркулиращите триглицериди и нивата на холестерола както при WT, така и при PRLR -/- мишки според промените в масата. Като цяло тези ефекти върху плазмените триглицериди не са свързани с увреждане/дисфункция на черния дроб.

Ефектът от лечението с PEG-SMLA върху трабекуларната кост

Дискусия

Освен многото функции, приписвани на PRL, участието му се характеризира най-добре с репродукцията, но сега е установено, че PRL има и метаболитни действия [17]. По-рано демонстрирахме, че въпреки увеличения прием на храна както при диетата с чау, така и при диетата с високо съдържание на мазнини (HFD), PRLR -/- мишките остават по-слаби от контролите и са защитени срещу индуцирано от HFD затлъстяване с значително намаляване на затлъстяването. Относителната резистентност към индуцирано от HFD затлъстяване се придружава от по-благоприятен хомеостатичен профил на въглехидрати при PRLR -/- мишки, в съответствие с основното отражение на PRL сигнализирането в енергийния баланс [11]. Тези мишки показват намалена мастна маса, свързана с появата на масивни кафявоподобни адипоцитни огнища в периренални и подкожни депа под HFD. Тези ефекти бяха по същество периферни поради увеличения разход на енергия и повишената скорост на метаболизма, тогава планирахме да дешифрираме централния PRL ефект. По този начин се възползвахме от наличието на лептинов суперактивен антагонист, за да изследваме неговите последици върху PRLR -/- мишки.

Както при WT, така и при PRLR -/- мишки се наблюдава непоносимост към глюкоза и увреждане на инсулиновата чувствителност, което показва, че липсата на PRLR не влияе върху наддаването на тегло, приема на храна, съдбата/диференциацията на адипоцитите и метаболитните параметри. Тези резултати не се вписват в предишни данни, показващи малко, но прогресивно намаляване на скоростта на наддаване на тегло и намаляване на мастната маса в корема при PRLR -/- мишки на чау диета [15]. Тези наблюдения обаче са документирани с 16-седмични животни, докато настоящото ни проучване е проведено върху 8-седмични мишки.

Костният анализ разкрива, че PRLR -/- мишките показват същите стойности на трабекуларен BV/TV като техния родителски щам 129/SvJ. Syberg et al [19] показват, че 129/SvJ мишки са тествали механично по-силна бедрена кост, по-висока костна минерална плътност и по-висока трабекуларна BV/TV в сравнение с мишки C57BL/6J. Лечението с PEG-SMLA повишава значително трабекуларната BV/TV както на PRLR -/- мишки, така и на WT в сравнение с нелекуваните животни, което предполага, че трабекуларната кост на третираните животни е по-плътна (т.е. има по-високо съдържание на материал на обем тъкан) и е следователно е вероятно да бъде по-ефективен в противопоставянето на натоварванията, действащи върху прешлените. Положителният ефект на инхибирането на лептина върху трабекуларната костна фракция и увеличаването на теглото при мишки, устойчиви на затлъстяване PRLR -/-, предполага, че сигналните пътища на лептин и PRL действат отделно един от друг.

Прекратяването на лечението с PEG-SMLA на 21 ден, повлиява теглото на WT и PRLR -/- мишки, които се връщат до почти контролно ниво и серумният инсулин и OGTT също се връщат към нормалните нива. Тези резултати показват, че PEG-SMLA дава възможност за обратимо индуциране на състояние на лептинов дефицит при PRLR -/- мишки, както и при други щамове на мишки, показани преди това [12], [13], [20].

Като цяло, нашите резултати демонстрират, че PRLR -/- мишки реагират драстично на лептинов антагонист, което предполага, че устойчивостта към HFD, показана по-рано [11], не е свързана с действието на лептин.

Благодарности

Авторите благодарят на В. Кео (Inserm U693, Le Kremlin-Bicêtre, F-94276, Франция) за техническа помощ и са задължени на L. Outin (Institut Biomédical de Bicêtre) за помощта му за хистоморфологични изследвания. Авторите са благодарни и на Marc Lombès (Inserm U693, Le Kremlin-Bicêtre, F-94276, Франция) за полезни дискусии.

Принос на автора

Замислени и проектирани експерименти: NC AG NB. Извършва експериментите: NC GS. Анализира данните: NC NB AG. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: NC GS. Написа хартията: NC AG NB.