Матиас Б. Мур

1 Катедра по биомедицински науки, Университет в Лозана, Лозана, Швейцария,

бъбреците

2 Националният център за компетентност в научните изследвания (NCCR) "Kidney.CH - Бъбречен контрол на хомеостазата" Швейцария, Цюрих Швейцария,

4 Настоящ адрес: Отделение по нефрология и хипертония, Университетска болница в Берн, Берн, Швейцария,

Оливие Бони

1 Катедра по биомедицински науки, Университет в Лозана, Лозана, Швейцария,

2 Националният център за компетентност в научните изследвания (NCCR) "Kidney.CH - Бъбречен контрол на хомеостазата" Швейцария, Цюрих Швейцария,

3 Служба по нефрология, Катедра по медицина, Университетска болница в Лозана, Лозана, Швейцария,

Свързани данни

Сурови данни са достъпни от авторите при поискване.

Резюме

Посредникът на клетъчната подвижност 1 (MEMO1) е повсеместно експресиран модулатор на клетъчни отговори на растежни фактори, включително сигнализиране на FGF23, а мишките с дефицит на Memo1 споделят някои фенотипни черти с модели на мишки с дефицит на Fgf23 или Klotho. Тук тествахме дали експресията на гена Memo1 се регулира от калциотропни хормони или чрез промяна на хранителния минерален товар. MLO-Y4 остеоцитоподобни клетки бяха култивирани и третирани с 1,25 (OH) 2-витамин D3. Мишки от див тип C57BL/6N са подложени на лечение с 1,25 (OH) 2-витамин D3, паратиреоиден хормон, 17β-естрадиол или носител. Други кохорти от мишки C57BL/6N са хранени с диети, различни по съдържание на калций или фосфат. Експресията на Memo1 и контролните гени се оценява чрез qPCR. 1,25 (OH) 2-витамин D3 причинява остро намаляване на нивата на транскрипт на Memo1 in vitro, но не in vivo. Нито един от тестваните хормони няма влияние върху транскриптите на Memo1, докато оценените контролни гени реагират по очаквания начин. Диетичните интервенции с калций и фосфат не засягат транскриптите на Memo1, но променят експресията на избраните контролни гени. Наблюдавахме, че Memo1 не се регулира от калциотропни хормони или промяна в минералното натоварване, което предполага големи разлики между регулацията и физиологичните роли на Klotho, Fgf23 и Memo1.

Резюме

MEMO1, нов регулатор на минералната хомеостаза, е безразличен към натоварването с калций или фосфат и калциотропните хормони като 1,25 (OH) 2-витамин D3, паратиреоиден хормон и 17β-естрадиол.

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Memo1 е еволюционен консервиран протеин във всички царства на живота, който показва вътреклетъчна експресия в цитоплазмата и ядрото (Haenzi et al., 2014; Moor, Haenzi, et al., 2018; Schlatter et al., 2012). Условен и индуцируем нокаут модел на мишка с постнатална делеция на екзон 2 от гена Memo1 е довел до синдром на стареене и преждевременна смърт с признаци като повишена калцемия, повишен FGF23 и 1,25 (OH) 2-витамин D3, костно заболяване, белодробен емфизем, атрофия на подкожната мастна тъкан, свръхчувствителност към инсулин и бъбречна недостатъчност (Haenzi et al., 2014; Moor, Ramakrishnan, et al., 2018). Този фенотип значително се припокрива с фенотипите на миши модели с дефицит на KLOTHO (Kuro ‐ o et al., 1997) или FGF23 (Shimada et al., 2004), два протеина, които значително промениха нашето разбиране за регулирането на метаболизма на калция и фосфатите чрез бъбреците и костите, а в по-малка степен и червата (Hu, Shiizaki, Kuro-O, & Moe, 2013; Moor & Bonny, 2016).

В допълнение, доказателства от експерименти с клетъчни култури, изследващи статуса на колокализация и фосфорилиране на адаптерните протеини, предполагат, че медиаторът на клетъчната подвижност 1 (MEMO1) протеин участва и модулира сигнална каскада, включваща FGF23 и FGFR (Haenzi et al., 2014).

Серумните анализи на мишки с дефицит на Klotho и Fgf23 показват прекомерни нива на 1,25 (OH) 2-витамин D3, констатация, която е променлива при мишки с дефицит на Memo1 в зависимост от генетичния произход (Haenzi et al., 2014; Moor, Ramakrishnan, et al., 2018). И двата промотора на Fgf23 и Klotho съдържат елементи на отговор на витамин D (VDRE) (Forster et al., 2011; Orfanidou, Malizos, Varitimidis и Tsezou, 2012). Секрецията на FGF23 се увеличава от паратиреоидния хормон (PTH) (Lavi-Moshayoff, Wasserman, Meir, Silver и Naveh-Many, 2010) и 17β-естрадиол (Carrillo-Lopez et al., 2009). По отношение на регулирането на Memo1, транскриптомен анализ на епифизните жлези на плъхове е открил увеличени транскрипти на Memo1 при лечение със синтетичен естроген в сравнение с контролите (Deffenbacher & Shull, 2006), подчертавайки потенциална ендокринна регулация на транскрипцията на гена Memo1. Ето защо ние тествахме хипотезата, че експресията на Memo1 може да се регулира от минерали или калцитропни стимули.

2. МЕТОДИ

2.1. Клетъчна култура

Дългите костни остеоцитно-Y4 клетъчни линии (MLO-Y4) бяха любезно предоставени от Lynda Bonewald (Kato, Windle, Koop, Mundy и Bonewald, 1997). MLO-Y4 клетките се поддържат в култура в минимална съществена алфа-модифицирана алфа-MEM (Gibco by Life Technologies), съдържаща 2,5% инактивиран телешки серум (Sigma), 2,5% инактивиран фетален говежди серум (Sigma), и 1% пеницилин/стрептомицин (Invitrogen на Life Technologies). Инактивирането на серумна топлина се извършва във водна баня при 56 ° С в продължение на 30 минути. Клетките се култивират върху колаген тип I от опашка на плъх (Invitrogen от Life Technologies). За стимулиране на витамин D клетките се държат в среда без серум, допълнена с 10 nM 1,25 (OH) 2-витамин D3 (Sigma) или етанолов носител за 24 часа.

2.2. Експерименти с животни

C57BL/6N мишки са получени от Janvier. Мишките бяха държани в конвенционално животно съоръжение с до шест животни на клетка и бяха хранени със стандартна лабораторна чау (Kliba Nafnag TS3242; калций 1%, фосфор 0,65%, магнезий 0,23%, витамин D 1600 IU/kg, витамин А 27 000 IU/kg, витамин Е 150 mg/kg, протеини 18,8%, сурови мазнини 5,6%, сурови фибри 3,5%, лизин 1,1%; KLIBA), освен ако не е посочено друго и са държани на 12/12 (експериментално) или 14/10 (разплод ) светлина-тъмни цикли. Всички експериментални протоколи за животни са одобрени от държавната ветеринарна служба на кантон дьо Во, Швейцария. За всички проучвания с мишки се вземат предвид размерите на пробите въз основа на предишни резултати в нашата лаборатория.

2.3. Диетични интервенции

За изследвания на минералния метаболизъм са използвани специално разработени диети и хормони. Проведени са експерименти с предизвикателство за калциева диета с пет мъжки мишки C57BL/6N на състояние в домашната им клетка, всички на възраст 12 седмици. Мишките бяха разпределени на случаен принцип, за да бъдат хранени с модификации на диетата KLIBA 2222, съдържаща или 0,17% (диета с ниско съдържание на калций), 0,82% (нормална диета с калций) или 1,69% (диета с високо съдържание на калций) (KLIBA, 2222) в продължение на 7 дни. Всички диети с калций съдържат фосфор 0,8%, витамин А 4000 IU/kg, витамин D 1000 IU/kg, витамин Е 100 mg/kg, протеини 18% и сурови мазнини 7%, лизин 14 g/kg (Kliba, 2222). За предизвикателство с фосфатна диета, три групи от пет мъжки мишки C57BL/6N, всички на възраст 13–14 седмици, бяха държани в метаболитни клетки и разпределени на случаен принцип за хранене с диети, съдържащи ниско (0,2%), междинно (0,8%) или високо (1,5 %) съдържание на фосфат за 7 дни. Фосфатните диети са модификации на диетата KLIBA 2222 (калций 1,2%, витамин А 4000 IU/kg, витамин D 1000 IU/kg, витамин Е 100 mg/kg, протеини 18%, сурови мазнини 7% и лизин 14 g/kg ).

2.4. Хормонални инжекции

Всички хормонални инжекции се извършват в домашната клетка на мишките след разпределяне на произволно третиране на отделни маркирани с уши мишки. За лечение с 1,25 (OH) 2-витамин D3, мъжки мишки C57BL/6N на възраст 13–15 седмици са инжектирани подкожно с 2 μg/kg телесно тегло 1,25 (OH) 2-витамин D3 (Sigma D1530) в етанол 1 % в NaCl 0,9%. Дозата и начинът на приложение са същите, както преди използваните в нашата лаборатория. Контролните мишки се инжектират с 1% (обем/обем) етанол в NaCl 0,9%. Мишките се умъртвяват 6 часа след инжектирането.

За лечение с PTH, мъжки мишки C57BL/6N на възраст 12–13 седмици са инжектирани подкожно с 80 μg/kg телесно тегло човешки PTH фрагмент 1–34 (hPTH1‐34) (Sigma P3796) в NaCl 0,9% или NaCl 0,9% самостоятелно като носител и се жертва 2 часа след инжектиране. Използваната доза и начин на приложение са определени от литературата (Kramer, Loots, Studer, Keller, & Kneissel, 2010).

За лечение с естрадиол, мъжки мишки C57BL/6N на възраст 16 седмици получават по една подкожна инжекция от 15 μg 17β-естрадиол (Sigma E8875) в етанол 0,1% (v/v) в NaCl 0,9% в продължение на пет последователни дни и са жертвани 4 часа след последната инжекция. Дозата на телесно тегло и начинът на приложение на лекарството са получени от литературата, както е показано Van Abel et al. (2002) за индуциране на експресия на Trpv5. Контролните мишки се инжектират подкожно с 0,1% етанол в NaCl 0,9% в продължение на 5 дни.

2.5. Дисекция на мишка

За евтаназия мишките се инжектират интраперитонеално с 0,1 mg/gBW кетамин (Ketanarkon 100 Vet., Streuli) и 0,02 mg/gBW ксилазин (Rompun, Bayer), последвано от крайно обезкървяване чрез орбитална пункция под пълна упойка и/или чрез цервикална дислокация. Органите бяха събрани, бъбреците бяха разрязани наполовина и органите бяха незабавно замразени в течен азот, последвано от съхранение при -80 ° C до по-нататъшна употреба.

2.6. Екстракция на РНК

РНК се екстрахира с помощта на TRI реагент (Applied Biosystems by Life Technologies) съгласно инструкциите на производителя. РНК пелетите бяха изсушени и разтворени в H2O без RNase. Концентрацията на РНК се измерва фотометрично, като се използва NanoDrop (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific). Оценява се съотношението РНК А260/А280 и всяка проба РНК се визуализира на 1% агарозен гел.

РНК се транскрибира обратно в cDNA, като се използва реакционният комплект PrimeScript RT (Takara Bio Inc). Входните количества на РНК на проба бяха 1-2 μg за костите, 500 ng за бъбреците или 1 μg MLO-Y4 РНК. Получената cDNA смес се разрежда 2–12 пъти в зависимост от типа тъкан.

2.7. qPCR

За количествен анализ на експресия на генна транскрипция, 2 μL кДНК бяха използвани за SYBR Green qPCR (Applied Biosystems by Life Technologies) на 7500 Fast machine (Applied Biosystems). Пробите се пускат в три екземпляра в общ обем от 20 μL за всеки ген и за нормализиране се използва актин или GAPDH. Криви на топене бяха получени за всеки цикъл. Настройките на програмата бяха: 95 ° C в продължение на 20 s, 40 цикъла (95 ° C 3 s, 60 ° C 30 s), а за етапа на кривата на топене: 95 ° C 15 s, 60 ° C 1 мин, покачване при 1% рампа скорост до 95 ° C (15 s) и 60 ° C 15 s. Данните бяха анализирани с помощта на делта-делта CT метод. Грундовете са поръчани от Microsynth (Швейцария) и последователностите са показани в Таблица 1. Всички амплифицирани продукти се визуализират на агарозни гелове.

маса 1

Грундове, използвани за qPCR

Олигонуклеотид 5'-последователност-3 '
Бележка1 напредGCTGCCCATGCTTACAAACAA
Memo1 обратнаAGAGTGCACATCGAGACAGG
Rankl напредGTCTGTAGGTACGCTTCCCG
Rankl обратноCATTTGCACACCTCACCATCAAT
Bglap напредCCGCCTACAAACGCATCTATG
Bglap заден ходGCTGCTGTGACATCCATACTTG
Phex напредGTGCATCTACCAACCAGATACG
Phex реверсTCTGTTCCCCAAAAGAAAGG
Slc34a3 напредCCTACCCCCTCTTCTTGGGT
Slc34a3 реверсAGAGCAACCTGAACTGCGAA
F3 напредACCTGGGCCTATGAAGCAAA
F3 заден ходGTTGGTCTCCGTCTCCATGAA
Cyp27b1 напредATGTTTGCCTTTGCCCAGA
Cyp27b1 реверсGACGGCATATCCTCCTCAGG,
Cyp24a1 напредGAAGATGTGAGGAATATGCCCTATTT
Cyp24a1 реверсCCGAGTTGTGAATGGCACACT
бета-актин напредGTCCACCTTCCAGCAGATGT
обратен бета-актинAGTCCGCCTAGAAGCACTTGC

2.8. Анализ на данни

Човешки промоторни последователности на Memo1 се анализират в силико, използвайки UCSC браузър за геном и сериен клонер 2.6.1.

Данните от експерименти с две независими групи бяха анализирани с t тест или U-тест на Mann-Whitney. За сравнение на три групи е използван тестът на Kruskal – Wallis с посттеста за множествено сравнение на Bonferroni. Всички статистически анализи бяха проведени с помощта на GraphPad PRISM 5.03. Двустранно p 1). За първи път бяха оценени известни зависими от витамин D транскрипти. Транскриптите на Cyp24a1, кодиращи инактивираща витамин D хидроксиляза (фигура 1а) и на остеокластния регулатор Rankl (фигура 1в), са увеличени при лечение с 1,25 (OH) 2-витамин D3, докато транскриптите на регулатора FGF23 Phex и експресията на костния хормон остеокалцинът/костният гама-карбоксиглутамат (Bglap) бяха намалени (Фигура 1 b, d). Преписите на Memo1 са намалени с 20% при лечение с 1,25 (OH) 2-витамин D3 (Фигура 1д).