Резюме

Посредникът на клетъчната подвижност 1 (MEMO1) е повсеместно експресиран модулатор на клетъчни реакции на растежни фактори, включително FGF23 сигнализиране, а мишките с дефицит на Memo1 споделят някои фенотипни черти с модели на мишки с дефицит на Fgf23 или Klotho. Тук тествахме дали експресията на гена Memo1 се регулира от калциотропни хормони или чрез промяна на хранителния минерален товар.

бъбреците

MLO-Y4 остеоцитоподобни клетки бяха култивирани и третирани с 1,25 (OH) 2-витамин D3. Мишките от див тип C57BL/6N са подложени на лечение с 1,25 (OH) 2-витамин D3, паратиреоиден хормон (PTH), 17β-естрадиол или носител. Други кохорти от мишки C57BL/6N са хранени с диети, различни по съдържание на калций или фосфат. Експресията на Memo1 и контролните гени се оценява чрез qPCR.

1,25 (OH) 2-витамин D3 причинява остро намаляване на нивата на транскрипт Memo1 in vitro, но не in vivo. Нито един от тестваните хормони няма влияние върху транскриптите на Memo1, докато оценените контролни гени реагират по очаквания начин. Диетичните интервенции с калций и фосфат не повлияват транскриптите на Memo1, но променят експресията на избраните контролни гени.

Наблюдавахме, че Memo1 не се регулира от калциотропни хормони или промяна в минералното натоварване, което предполага големи разлики между регулацията и физиологичните роли на Klotho, Fgf23 и Memo1.

Въведение

Memo1 е еволюционен консервиран протеин във всички царства на живота, който показва вътреклетъчна експресия в цитоплазмата и ядрото (Schlatter et al., 2012, Haenzi et al., 2014, Moor MB, 2018). Условен и индуцируем нокаут модел на мишка с постнатална делеция на екзон 2 от гена Memo1 е довел до синдром на преждевременно стареене с повишена калцемия, повишен FGF23, свръхчувствителност към инсулин и костни заболявания (Haenzi et al., 2014, Moor, 2018). Тези черти споделят частично припокриване с модели на мишки с дефицит на KLOTHO (Kuro-o et al., 1997) или FGF23 (Shimada et al., 2004), два протеина, които значително промениха нашето разбиране за регулирането на метаболизма на калция и фосфатите чрез червата, бъбреците и костите (Hu et al., 2013, Moor and Bonny, 2016).

В допълнение, доказателства от експерименти с клетъчни култури, изследващи състоянието на колокализация и фосфорилиране на адаптерни протеини, предполагат, че протеинът MEMO1 участва и модулира сигнална каскада, включваща FGF23 и FGFR (Haenzi et al., 2014).

Серумните анализи на мишки с дефицит на Klotho и Fgf23 показват прекомерни нива на 1,25 (OH) 2-витамин D3, констатация, която е променлива при мишки с дефицит на Memo1 в зависимост от генетичния произход (Haenzi et al., 2014, Moor, 2018). И двата промотора на Fgf23 и Klotho съдържат елементи на отговор на витамин D (Forster et al., 2011, Orfanidou et al., 2012). Секрецията на FGF23 се увеличава от паратиреоидния хормон (PTH) (Lavi-Moshayoff et al., 2010) и 17β-естрадиол (Carrillo-Lopez et al., 2009). По отношение на регулирането на Memo1, транскриптомен анализ на епифизни жлези на плъхове е открил увеличени транскрипти на Memo1 при лечение със синтетичен естроген в сравнение с контролите (Deffenbacher, 2006), подчертавайки потенциална ендокринна регулация на транскрипцията на гена Memo1. Ето защо тествахме хипотезата, че експресията на Memo1 може да се регулира от минерали или калцитропни стимули.

Методи

Клетъчна култура

Дългите костни остеоцит-Y4 клетъчни линии (MLO-Y4) бяха любезно предоставени от Lynda Bonewald (Kato et al., 1997). MLO-Y4 клетките се поддържат в култура в минимална съществена алфа-модифицирана алфа-MEM (Gibco от Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ), съдържаща 2,5% дезактивиран телешки серум (Sigma), 2,5% дезактивиран фетален плод говежди серум (Sigma) и 1% пеницилин/стрептомицин (Invitrogen от Life Technologies). Инактивирането на топлина в серума се извършва във водна баня при 56 ° С в продължение на 30 минути. Клетките се култивират върху колаген тип I от плъх опашка (Invitrogen от Life Technologies). За стимулиране на витамин D клетките се държат в среда без серум, допълнена с 10nM 1,25 (OH) 2-витамин D3 (Sigma) или етанолов носител в продължение на 24 часа.

Експерименти с животни

C57BL/6N мишки са получени от Janvier (Le Genest-Saint-Isle, Франция). Мишките бяха държани в конвенционално животно съоръжение с до 6 животни на клетка и бяха хранени със стандартна лабораторна чау (Kliba Nafnag TS3242; калций 1%, фосфор 0,65%, магнезий 0,23%, витамин D 1600 IU/kg, витамин А 27000 IU/kg, витамин Е 150 mg/kg, протеини 18,8%, сурови мазнини 5,6%, сурови фибри 3,5%, лизин 1,1%; KLIBA Kaiseraugst, Швейцария), освен ако не е посочено друго и са били държани на 12/12 (експериментално) или 14/10 (размножителни) светло-тъмни цикъла. Всички експериментални протоколи за животни са одобрени от държавната ветеринарна служба на кантон дьо Во, Швейцария. За всички проучвания с мишки се вземат предвид размерите на пробите въз основа на предишни резултати в нашата лаборатория.

Диетични интервенции

За изследвания на минералния метаболизъм са използвани специално разработени диети и хормони. Проведени са експерименти с предизвикателство за калциева диета с 5 мъжки мишки C57BL/6N на състояние в домашната им клетка, всички на възраст 12 седмици. Мишките бяха разпределени на случаен принцип, за да бъдат хранени с модификации на диетата KLIBA 2222, съдържаща или 0,17% (диета с ниско съдържание на калций), 0,82% (нормална диета с калций) или 1,69% (диета с високо съдържание на калций) (KLIBA, 2222) в продължение на 7 дни. Всички диети с калций съдържат фосфор 0,8%, витамин А 4000 IU/kg, витамин D 1000 IU/kg, витамин E100 mg/kg, протеини 18%, сурови мазнини 7%, лизин 14 g/kg (Kliba, 2222). За предизвикателство с фосфатна диета, 3 групи от 5 мъжки мишки C57BL/6N, всички на възраст 13-14 седмици, бяха държани в метаболитни клетки и произволно разпределени за хранене с диети, съдържащи ниско (0,2%), междинно (0,8%) или високо (1,5 %) съдържание на фосфат за 7 дни. Фосфатните диети са модификации на диетата KLIBA 2222 (калций 1,2%, витамин А 4000 IU/kg, витамин D 1000 IU/kg, витамин E100 mg/kg, протеини 18%, сурови мазнини 7%, лизин 14g/kg).

Хормонални инжекции

Всички хормонални инжекции се извършват в домашната клетка на мишките след разпределяне на произволно третиране на отделни маркирани с уши мишки. За лечение с 1,25 (OH) 2-витамин D3, мъжки мишки C57BL/6N на възраст 13-15 седмици са инжектирани подкожно с 2 μg/kg телесно тегло 1,25 (OH) 2-витамин D3 (Sigma D1530) в етанол 1 % в NaCl 0,9%. Дозата и начинът на приложение са същите, както преди използваните в нашата лаборатория. Контролните мишки се инжектират с 1% (обем/обем) етанол в NaCl 0,9%. Мишките се умъртвяват 6 часа след инжектирането.

За лечение на паратиреоиден хормон, мъжки мишки C57BL/6N на възраст 12-13 седмици са инжектирани подкожно с 80 μg/kg телесно тегло човешки PTH фрагмент 1-34 (hPTH1-34) (Sigma P3796) в NaCl 0,9% или NaCl 0,9% самостоятелно като превозно средство и се жертва 2 часа след инжектирането. Използваната доза и начин на приложение са определени от литературата (Kramer et al., 2010).

За лечение с естрадиол, мъжки мишки C57BL/6N на възраст 16 седмици получават 1 подкожно инжектиране на 15 μg 17β-естрадиол (Sigma E8875) в етанол 0,1% (v/v) в NaCl 0,9% в продължение на 5 последователни дни и са жертвани 4 часа след последния инжекция. Дозата на телесно тегло и начинът на приложение на лекарството са получени от литературата, както е показано Abel et al. за индуциране на експресия на Trpv5 (Van Abel et al., 2002). Контролните мишки се инжектират подкожно с 0,1% етанол в NaCl 0,9% в продължение на 5 дни.

Дисекция на мишка

За евтаназия мишките се инжектират интраперитонеално с 0,1 mg/gBW кетамин (Ketanarkon 100 Vet., Streuli) и 0,02 mg/gBW ксилазин (Rompun, Bayer), последвано от крайно обезкървяване чрез орбитална пункция под пълна упойка и/или чрез цервикална дислокация. Органите бяха събрани, бъбреците бяха разрязани наполовина и органите бяха незабавно замразени в течен азот, последвано от съхранение при -80 ° C до по-нататъшна употреба.

Екстракция на РНК

РНК беше извлечена с помощта на реагент TRI (Applied Biosystems by Life Technologies) съгласно инструкциите на производителя. РНК пелетите бяха изсушени и разтворени в Н2О без RNase. Концентрацията на РНК се измерва фотометрично, като се използва Nanodrop (Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Оценява се съотношението РНК А260/А280 и всяка РНК проба се визуализира на 1% агарозен гел. РНК се транскрибира обратно в cDNA, използвайки реакционния комплект PrimeScript RT (Takara Bio Inc, Otsu, Япония). Входните количества на РНК на проба бяха 1-2 μg за кост, 500ng за бъбрек или 1 μg от MLO-Y4 РНК. Получената cDNA смес се разрежда 2-12 пъти в зависимост от типа тъкан.

За количествен анализ на експресия на генна транскрипция, 2uL сДНК се използва за SYBR Green qPCR (Applied Biosystems by Life Technologies) на 7500 Fast machine (Applied Biosystems). Пробите се пускат в три екземпляра в общ обем от 20 uL за всеки ген и за нормализиране се използва актин или GAPDH. Криви на топене бяха получени за всеки цикъл. Настройките на програмата бяха: 95 ° C в продължение на 20 секунди, 40 цикъла (95 ° C 3 секунди, 60 ° C 30 секунди), а за етапа на кривата на топене: 95 ° C 15 секунди, 60 ° C 1 минута, нарастващи при скорост от 1% 95 ° C (15sec), 60 ° C 15sec. Данните бяха анализирани с помощта на делта-делта CT метод. Грундовете бяха поръчани от Microsynth (Швейцария) и последователностите са показани в Таблица 1. Всички амплифицирани продукти бяха визуализирани на агарозни гелове.