• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: Mark_Jedrychowski @ hms.harvard.eduEdwardT_Chouchani @ dfci.harvard.eduBruce_Spiegelman @ dfci.harvard.edu

Принос от Брус М. Шпигелман, 27 март 2020 г. (изпратено за преглед на 24 януари 2020 г .; прегледано от Дейвид Дж. Мангелсдорф и Лучия А. Сийл)

протеини

Значимост

Окисляването на цистеини от реактивни кислородни видове (ROS) инициира термогенеза в кафяви и бежови мастни тъкани. Клетъчните селеноли, където селенът замества сярата, проявяват повишена реактивност с ROS. Тук разработихме масспектрометричен метод за разследване на включването на селеноли в протеини. Неочаквано този подход разкрива факултативно включване на селен в протеини, които нямат канонично кодиране за селеноцистеин. Селенът беше селективно включен в регулаторни сайтове на ключови метаболитни протеини, включително като селеноцистеин, заместващ цистеин в позиция 253 в UCP1 разединяващ протеин 1 (UCP1). Забележително е, че хранителните добавки със селен повишават факултативното включване в UCP1, повишават енергийните разходи чрез термогенна мастна тъкан и предпазват от затлъстяване. Заедно тези открития разкриват съществуването на факултативна селеция на протеин, която корелира с ефектите върху термогенната функция на адипоцитите.

Резюме

Резултати

Масспектрометричен метод за идентификация на селеноцистеин-съдържащи протеини.

Първо разработихме подход с насочена МС за определяне на Sec-съдържащи пептиди. Подобно на Cys, Sec реагира ефективно и необратимо с дериватизиращи тиол агенти, като N-етилмалеимид (NEM) и йодоацетамид (IAM), които обикновено се използват в редокс-протеомните работни процеси (9). Следователно, по принцип, Sec-съдържащите пептиди могат лесно да бъдат идентифицирани чрез ясно изместване на масата, съответстващо на масата на Sec + ковалентния конюгат на дериватизиращия агент (9, 10). Важно е, че селенът има разпределение на естествено срещащи се стабилни изотопи, които не се срещат в нито един друг елемент. В допълнение към най-разпространения изотоп, 80 Se (~ 50% общо), четири други стабилни изотопа показват достатъчно естествено изобилие, за да бъдат разграничени от MS, като по този начин генерират уникален изотопен подпис (SI Приложение, Фиг. S1A). Следователно, пептид, съдържащ добросъвестен заместител на цистеин-селеноцистеин, има следните отличителни черти при анализ на MS. Те трябва да имат маса на фрагментен спектър, приписваща се на Sec в Cys локус (Фиг. 1B, отдолу), която може да бъде изместена в маса чрез дериватизация със Sec-реактивни нуклеофили към масата на Sec + дериватизиращия агент (Фиг. 1B, Middle) . Освен това този пептид трябва да показва уникалния Sec mass isotope fingerprint (фиг. 1В, отгоре).

Валидиране и количествено определяне на UCP1-Sec253.

За да потвърдим идентичността на предполагаемия UCP1 селен-съдържащ пептид, генерирахме синтетичен пептид, идентичен на ендогенния UCP1 Cys253 пептид със заместител на селеноцистеин в позиция 253 и изотопно тежък тирозин (AQUA [Абсолютно количествено определяне] пептид + 10.0272 Da; SI Приложение, Фиг. S3 A ​​и B). Тази молекула дава възможност както за идентификация, така и за количествено определяне на ендогенния селектиран пептид. За да се определи присъствието на UCP1 Sec253 в протеома на кафявата мазнина, стандартът AQUA се дериватизира с отчетлив репортер на изобарен тандемен масов маркер (TMT). По този начин AQUA пептидът позволява ендогенна идентификация на пептид чрез мултиплексиране (SI Приложение, Фиг. S3D). Установихме, че ендогенният UCP1 пептид показва физикохимични свойства, идентични със стандарта AQUA, потвърждавайки присъствието на Sec в позиция 253 на UCP1 (SI Приложение, Фиг. S3D).

Използването на вътрешния стандарт на AQUA позволи оценка на стехиометрията на селенационната заместител на цистеин в позиция 253. Ние изследвахме стехиометрията на селенацията в НДНТ от диви видове (WT) мъжки мишки при стандартни условия на отглеждане. В този случай включването на селен се изчислява на ~ 4-5% от общия UCP1 протеин (фиг. 2А). По този начин при тези условия изглежда, че малка, но значителна част от UCP1 съществува в избрана форма.

Характеризиране на включването на селеноцистеин в локуса UCP1 253. (А) Пропорция на селеноцистеин 253 форма на UCP1, изчислена с помощта на вътрешни стандартни AQUA пептиди. (Б) Относително изобилие от форми на селенова киселина и сулфенова киселина на UCP1; n = 3. (C) Авторадиограма на WT и UCP1KO кафяви адипоцитни лизати, третирани с натриев 75 Se-селенит по време на диференциацията. Видна лента в региона от 20 до 25 kDa показва добре установено семейство GPx селенопротеини. Няма видим сигнал в областта на молекулното тегло (MW) на UCP1 (∼33 kDa). (D) Относителни промени в съдържанието на селеноцистеиновата форма на UCP1 в кафяви адипоцити, третирани с натриев селенит; n = 3. (E) Относителни промени в съдържанието на селеноцистеиновата форма на UCP1 в кафяви адипоцити, третирани със селенометионин; n = 3. (F) Относителни промени в съдържанието на селеноцистеиновата форма на UCP1 в кафяви адипоцити, третирани със селеноцистеин (SeCys); n = 3.

По-рано установихме, че UCP1 Cys253 тиол може да стане окислително модифициран до сулфенова киселина при активиране на термогенезата in vivo, физиологичен стимул, който увеличава нивата на ROS в НДНТ. Освен това, въз основа на мутагенеза и фармакологична манипулация на този остатък, модификацията на този сайт е достатъчна, за да повлияе на функцията на UCP1. Sec показва изключителна чувствителност към окислителна модификация в сравнение с Cys, така че изследвахме дали селектираният UCP1 е по-чувствителен към окислителната модификация. Забележително е, че открихме, че при изходни условия, когато Cys253 е предимно немодифициран, Sec253 се окислява значително до селенова киселина (фиг. 2В). Следователно, Sec253 формата на UCP1 представлява съществен и отчетлив пул от протеин, който е силно чувствителен към окисляване.

Факултативно включване на селен в протеини се случва по неканоничен път.

След това изследвахме как селенът може да бъде включен в протеини като UCP1, чиято последователност не съдържа видимо кодиране за включване на Sec чрез установени котранслационни пътища. Котранслационното включване на селен като Sec се улеснява от отделен механизъм за зареждане на трансферна РНК (tRNA), който използва неорганичен селенит като източник на селен. В допълнение, органичните форми на селен могат да допринесат за този котранслационен път чрез освобождаването на селенид или неговите производни. Този начин на включване може да се наблюдава чрез авторадиография на протеини след добавяне със 75 Se-селенит. 75 третирани със селенит кафяви адипоцити показват стабилно маркиране на протеини с молекулни маси, съответстващи на добре установени селенопротеини, но не се наблюдава сигнал при молекулната маса, съответстваща на UCP1 (фиг. 2С). Въпреки това, включването на Sec253 в UCP1 беше лесно очевидно от MS на кафявия адипоцитен протеин, което предполага, че факултативното включване на Sec се извършва независимо от този котранслационен път.

За да тестваме това допълнително, ние лекувахме първични кафяви адипоцити с нарастващи концентрации на натриев селенит по време на диференциацията, когато UCP1 протеинът се генерира de novo при високи нива. Както се очаква, натриевият селенит увеличи изобилието от класически селенопротеини, за които включването на Sec се осъществява котранслационно (SI Приложение, Фиг. S3E). При тези условия обаче натриевият селенит няма ефект върху нивата на UCP1-Sec253 (фиг. 2D). След това обмислихме дали други форми на селен могат да допринесат за факултативно включване в протеини. Органичните форми на селен са основен източник на селен и могат да се генерират от селенит чрез системен метаболизъм от микроби и много други организми. Сред най-разпространените форми на органичен селен е селенометионинът. Когато кафявите адипоцити бяха допълнени със селенометионин по време на диференциацията, делът на Sec253 формата на UCP1 се увеличи значително (Фиг. 2Е). Интересното е, че това не се наблюдава, когато клетките се допълват с другата основна органична форма на селен, селеноцистеин (под формата на селеноцистин, който е окислената форма на селеноцистеин) (Фиг. 2F).

Важното е, че триптичният пептид на UCP1, който съдържа Sec253, също съдържа два метионина. Следователно, наблюдаваното увеличаване на селенацията на този пептид след лечение със селенометионин може да се дължи на включването на селенометионин вместо на селеноцистеин. За да разграничим тези две възможности, ние изследвахме фрагментните спектри на селектирания UCP1 триптичен пептид. Чрез изследване на b и y йони, обхващащи локуса Cys и Met, установихме, че добавянето на селен се дължи изключително на позиция 253 (фиг. 1 D – G и приложение SI, фиг. S3E).

Диетичната добавка на селен променя както задължителните, така и факултативните селенопротеини, но при различни диетични концентрации.

Диетичният селен модифицира диференциално каноничното и факултативното селезиране на протеини. (А) Експресия на канонични селенопротеини, картографирани в това проучване на НДНТ и модулирани от 0,1 до 0,4 ppm диетичен натриев селенит; n = 5. (B) Идентифициране на селективно факултативно вмъкване на селеноцистеин в метаболитни протеини на НДНТ; n = 5. (C) Идентифициране на селективно факултативно вмъкване на селенометионин в метаболитни протеини на НДНТ; n = 5. (D) Идентифициране на селективно факултативно вмъкване на селенометионин и селеноцистеин в s.c. бели протеини на мастната тъкан; n = 5. (E) 2.25-ppm диетичен селен увеличава количеството Sec253 UCP1; n = 5.

Също така идентифицирахме многобройни случаи на селективно, неслучайно включване на селен като селенометионин в локусите, кодиращи метионин (Фиг. 3С). По-голямата част от целите на вмъкването на селенометионин са също основните метаболитни ензими и протеини, обработващи мастни киселини. Освен това някои протеини, като свързващ мастна киселина протеин 4, показват отделни случаи на включване на селеноцистеин и селенометионин (фиг. 3 В и С). Успоредно с това изследвахме подкожната бяла мастна тъкан за наличие на факултативни места на селенометионин и селеноцистеин. Идентифицирахме едно факултативно място на селеноцистеин и едно място на селенометионин (Фиг. 3D). След това изследвахме дали транскриптите, кодиращи протеини, които съдържат факултативни сайтове на селеноцистеин и селенометионин, показват някакви структурни характеристики, предполагащи котранслационни регулаторни елементи.

Геномни характеристики на гени, кодиращи протеини с факултативно селециониране.

Диетичният статус на селен регулира термогенезата на мастните тъкани и модифицира обезогенезата.

За отбелязване е, че между 0,1 и 0,4 ppm диетичен селен е бил достатъчен, за да се увеличи максимално класическата експресия на селенопротеин в НДНТ. Чрез количествено определяне на UCP1-Sec253 установихме, че селенацията на този сайт е повишена само с 2,25 ppm селенит (фиг. 3Е). Следователно прагът за задължителен синтез на селенопротеин и факултативна селенация на UCP1 изглежда са различни.

Тъй като повишаването на хранителния селен е достатъчно за засилване на термогенезата на НДНТ чрез β3-адренорецепторен агонизъм, ние изследвахме дали тази намеса може да промени физиологичния отговор на храненето с високо съдържание на мазнини. Сравнихме 1) мишки, поглъщащи диета с високо съдържание на мазнини (HFD), допълнена с 0,1-ppm диетичен селен, ниво, достатъчно за експресия на селенопротеини в НДНТ (фиг. 3А) и без ефект върху термогенезата на НДНТ (фиг. 4 D – F ); и 2) мишки, поглъщащи HFD, допълнен с диетичен селен от 2,25 ppm, ниво, достатъчно за повишаване на факултативната селекция на UCP1 в НДНТ (фиг. 3С) и стимулиране на термогенезата на НДНТ (фиг. 4 D – F). Както е показано на фиг. 4 G и H, мишките с 2,25 ppm селенови диети показват силна защита срещу увеличаване на теглото при хранене с високо съдържание на мазнини в продължение на 14 седмици. Освен това този ефект се дължи конкретно на намаляване на мастната маса (фиг. 4I). Забележително е, че тази защита срещу затлъстяване е настъпила, въпреки че няма забележими промени в приема на храна (фиг. 4J) и липса на повишаване на чернодробното възпаление или фиброза (фиг. 4K и приложение SI, фиг. S6).

Дискусия

Взети заедно, тези открития предполагат неканонична парадигма за кодиране на подобрена редокс чувствителност и функционалност в протеини. Освен това те демонстрират, че модифицирането на селеновия статус в диетата може да бъде относително просто средство за повишаване на термогенната функция в мастните тъкани и модифициране на затлъстяването при хората.

Методи

Експерименти с животни.

Експериментите с животни бяха извършени, както е описано по-горе (3), в съответствие с процедурите, одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Медицинския център на Бет Израел за дяволите Мишките бяха мъжки C57BL/6J (на възраст 12 седмици; лаборатории Jackson) и бяха настанени в контролирана температура (23 ° C) стая при 12-часов цикъл светлина-тъмнина.

Подготовка и диференциация на първични кафяви адипоцити.

Междукапуларна кафява мастна стромална съдова фракция е получена, както е описано по-горе (3).

Подготовка на пробата за масова спектрометрия.

Пробите се хомогенизират в 50-mM Tris база, съдържаща 100-mM NaCl, 100-μM диетилентриамин пентаацетат (DTPA), 0,1% натриев додецил сулфат (SDS), 0,5% натриев дезоксихолат, 0,5% Triton X-100, 10-mM трис ( 2-карбоксиетил) фосфин (TCEP) и 50-тМ йодоацетамид или 50-тМ NEM в зависимост от експеримента. След инкубация в продължение на 15 минути, SDS беше добавен до крайна концентрация от 1% и пробите бяха инкубирани за още 15 минути.

Храносмилане на протеини.

Протеиновите пелети бяха изсушени и ресуспендирани в 8-М карбамид, съдържащ 50-тМ Hepes (рН 8.5). Концентрациите на протеини се измерват с анализ на бицинхонинова киселина (ThermoFisher Scientific) преди разграждането на протеазата. Протеиновите лизати се разреждат до 4-М урея и се усвояват с LysC (Wako, Япония) в съотношение 1/100 ензим/протеин за една нощ. Протеиновите екстракти се разреждат допълнително до 1.0-М концентрация на урея и трипсин (Promega) се добавя към окончателно съотношение 1/200 ензим/протеин за 6 часа при 37 ° С. Храносмиланията се подкисляват с 20-μL 20% мравчена киселина (FA) до рН ∼2 и се подлагат на екстракция в твърда фаза C18 (50 mg SepPak, Waters).

LC – MS/MS параметри за пептиден анализ.

Всички спектри са получени с помощта на масспектрометър Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) в съответствие с помпа за течна хроматография с високо налягане Easy LLC 1000 (ThermoFisher Scientific), както е описано по-горе (3, 18).

Оценка на протеинови тиолсулфенови киселини.

НДНТ е подготвен, като адаптира протокол, използван преди това за стабилизиране на ендогенни протеинови сулфенови киселини (18). Накратко, пробите се хомогенизират в 50-mM Tris база, съдържаща 100-mM NaCl, 100-μM DTPA, 0,1% SDS, 0,5% натриев дезоксихолат, 0,5% Triton-X 100 и 5-тМ димедон. За да се сведе до минимум зависимото от лизис окисление, буферите се барботират с аргон преди употреба. Пробите се инкубират в продължение на 15 минути при стайна температура, след което се добавя SDS до крайна концентрация от 1% и пробите се инкубират за още 15 минути. След третиране с димедон се добавят 10-mM TCEP и 50-mM NEM и пробите се инкубират за още 15 минути при 37 ° С, за да се намалят и алкилират всички остатъци от цистеин на несулфенова киселина. След това пробите бяха подложени на смилане на протеини и LC-MS/MS, както е описано по-горе.

Определяне на пептиди, съдържащи селеноцистеин и селенометионин.

Количествено определяне на UCP1 Sec253 пептид с помощта на тежки стандартни AQUA пептиди.

AQUA пептидите, използвани в това проучване, са както следва, където U * = селеноцистеин и Y = тежък тирозин 10.027228): AQUA пептид/последователност/маса (Da) Тежки; UCP1 240–261/FINSLPGQYPSVPSU * AMSMYTK/2477.20; и UCP1 240–261/FINSLPGQYPSVPSCAMSMYTK/2430.149.

Версия 19.1.0.193 на Skyline е използвана за количествено определяне на абсолютни и относителни количества UCP1 253 селеноцистеин и цистеин във всички експерименти, като тежки AQUA пептиди са използвани като еталон (21).

Геномни анализи на факултативно селетираните протеини.

Определяне на включването на селенит с помощта на натрий 75 Se-селенит.

Кафявите адипоцити се диференцират, както е описано по-горе. Прясно неутрализиран 75 Se-селенит се добавя към клетките (5-mCi/mL среда) от ден 0 и при всяка среда се променя по време на диференциацията до ден 7. След етикетирането клетките се събират, лизират, количествено определят протеини и се отделят върху SDS/полиакриламид гел електрофореза. Отделените протеини се прехвърлят върху поливинилиденфлуоридни мембрани и се анализират с Typhoon PhosphorImager, както е описано по-горе (26).

Натриев селенит Диетична намеса и хранене с високо съдържание на мазнини.

Всички диетични експерименти с мишки и хранене с високо съдържание на мазнини бяха проведени с контроли, съответстващи на възрастта. На 8-седмична възраст мишките са преминали на чау [Envigo 99256 – дефицит на селен (SD; 99257–0,1-ppm Se; 01390–0,4-ppm Se; 01391–2,25-ppm Se)] или диета с високо съдържание на мазнини (Envigo SD 170392; 2.25-ppm Se 170441), съдържащ определени количества натриев селенит. Диетичната интервенция продължи 8 седмици преди молекулярните анализи.

Анализ на телесния състав.

Съставът на тялото беше изследван с Echo MRI (Echo Medical Systems) с помощта на 3-в-1 Echo MRI композиционен анализатор.

Метаболитен фенотип.

Енергийният метаболизъм на цялото тяло беше оценен с помощта на цялостна лабораторна система за наблюдение на животните (CLAMS; Columbia Instruments). Нивата на CO2 и O2 се събират на всеки 30 s. CL 316,243 (1 mg kg -1; Sigma-Aldrich;) беше инжектиран интраперитонеално на мишки в посочените часове.

Декларация за наличност на данни.

Данните са достъпни чрез ProteomeXchange с идентификатор PXD018225.

Благодарности

Работата беше подкрепена от програмата Claudia Adams Barr (за ETC и MPJ), NIH Grant DK123095 (за ETC), NIH Grants DK117149 и CA080946 (за VNG), NIH Grant GM132129 (за JAP) и JPB Foundation (за BMS ).

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого може да бъде адресирана кореспонденция. Имейл: Mark_Jedrychowskihms.harvard.edu, EdwardT_Chouchanidfci.harvard.edu или Bruce_Spiegelmandfci.harvard.edu .