Хосе О. Алеман

1 Лаборатория по биохимична генетика и метаболизъм, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

2 Катедра по медицина, Мемориален център за рак на Sloan-Kettering, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

8 Катедра по медицина, Медицински колеж Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Нийл М. Айенгар

2 Катедра по медицина, Мемориален център за рак на Sloan-Kettering, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Жана М. Уокър

3 Болница Рокфелер, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Джинджифил Л. Милн

4 Отдел по клинична фармакология, Медицински център на университетския университет Вандербилт, Нашвил, Тенеси 37232

Джоел Корея Да Роза

3 Болница Рокфелер, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Юпу Лианг

3 Болница Рокфелер, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Дилип Д. Гири

5 Катедра по патология, Мемориален център за рак на Слоун-Кетеринг, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Си Кати Джоу

6 Департамент по здравна политика и изследвания, Медицински колеж Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Майкъл Н. Полак

7 Катедри по медицина и онкология, Университет Макгил, Монреал, Квебек H3T 1E2, Канада

Клифорд А. Худис

2 Катедра по медицина, Мемориален център за рак на Sloan-Kettering, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Ян Л. Бреслоу

1 Лаборатория по биохимична генетика и метаболизъм, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Питър Р. Холт

1 Лаборатория по биохимична генетика и метаболизъм, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Андрю Дж. Даненберг

8 Катедра по медицина, Медицински колеж Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк 10065

Резюме

Контекст:

Затлъстяването е свързано със субклинично възпаление на бялата мастна тъкан, както се определя от наличието на короноподобни структури (CLS), състоящи се от мъртви или умиращи адипоцити, обградени от макрофаги. При хората загубата на тегло, причинена от бариатрична хирургия, води до намаляване на CLS, но ефектите от бързата индуцирана от диетата загуба на тегло върху CLS и метаболизма са неясни.

Обективен:

За да се определят ефектите от бързата загуба на тегло, предизвикана от много нискокалорична диета, върху плътността на CLS, системните биомаркери на възпалението и метаболизма при затлъстели жени в постменопауза.

Дизайн:

Проспективно кохортно проучване.

Настройка:

Университетска болница Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк.

Участници:

Десет жени със затлъстяване в постменопауза със средна възраст 60,6 години (стандартно отклонение, ± 3,6 години).

Основни изходни мерки:

Измервани са ефекти върху плътността на CLS и експресията на гена в абдоминалната подкожна мастна тъкан, кардиометаболитни рискови фактори, бели кръвни клетки, циркулиращи метаболити и оксидативен стрес (изопростан-М в урината).

Резултати:

Затлъстелите лица са загубили приблизително 10% телесно тегло за средно 46 дни. CLS плътността се увеличава в подкожната мастна тъкан без свързано увеличение на експресията на възпалителния ген. Загубата на тегло е придружена от намалени гладни кръвни нива на високочувствителен С-реактивен протеин, глюкоза, лактат и кинуренин и повишени нива на циркулиране на свободни мастни киселини, глицерол, β-хидроксибутират и 25 хидроксивитамин D. М отказа.

Заключение:

Бързата загуба на тегло стимулира липолизата и увеличаването на CLS плътността в подкожната мастна тъкан във връзка с промени в нивата на циркулиращите метаболити и подобрени системни биомаркери на възпалението и инсулиновата резистентност. Наблюдаваната промяна в нивата на метаболитите (т.е. лактат, β-хидроксибутират, 25 хидроксивитамин D) може да допринесе за противовъзпалителния ефект на бързата загуба на тегло.

Бързата загуба на тегло, предизвикана от диета, увеличава плътността на структурата, подобна на мастната корона при затлъстели жени в постменопауза.

При затлъстели гризачи продължителното ограничаване на калориите е свързано с намаляване на CLS и намалена експресия на провъзпалителни гени [11]. За разлика от това, бързата загуба на тегло води до повишена инфилтрация на макрофаги във висцералната и подкожната мастна тъкан [12]. При хората загубата на тегло, причинена от бариатрична хирургия, води до намаляване на CLS, подобряване на системното възпаление и намалена инсулинова резистентност и, вероятно, риск от рак [13]. Също така са изследвани ефектите от медиирана от много нискокалорична диета (VLCD) бърза загуба на тегло. Clément и колеги [14] съобщават, че индуцираната от VLCD бърза загуба на тегло води до значително намаляване на мастната маса във връзка с подобрена чувствителност към инсулин, намалени нива на циркулиращ триглицерид и холестерол, както и промени в експресията на подкожната мастна тъкан. Съществуват значителни доказателства, че кръстосаните разговори между мастната тъкан и дисталните тъкани, включително черния дроб, панкреаса и скелетните мускули, могат да повлияят на здравето [15].

Въпреки че са докладвани ефектите от бързата загуба на тегло върху нивата на циркулиращи адипокини и липиди [16, 17], много по-малко се знае за ефектите върху системните нива на метаболитите. В това проучване нашата основна цел беше да изследваме ефектите от индуцирана от VLCD загуба на тегло върху плътността на CLS, системните биомаркери на възпалението и метаболизма при жени със затлъстяване в постменопауза.

1. Материали и методи

А. Субекти

Допустимите субекти са били със затлъстяване (индекс на телесна маса, ≥35 kg/m 2) жени в менопауза (дефинирани от> 2 години без менструални периоди). Участниците бяха наети от общността чрез реклама или участие в регистър на болница Рокфелер на субекти, които преди това бяха проверени за научни изследвания. Изключихме субекти с клинично ССЗ; диабет тип 2 и получаване на орални хипогликемични средства; пушачи; редовни потребители на аспирин, рибено масло или добавки с витамин D; анамнеза за стомашно-чревни операции, различни от апендектомия; или рак на гърдата и други видове рак. Четиринадесет субекта бяха изследвани и 12 от тях бяха оценени и записани. По време на проучването двама субекти отпаднаха: един поради остър конюнктивит и друг поради невъзможност да се придържат към диетата. От завършилите проучването трима бяха бели, четири бяха черни и трима бяха латиноамериканци. Това беше едноцентрово проучване, проведено в Университетската болница Рокфелер между септември 2012 г. и август 2013 г. Субектите бяха подложени на пълен медицински преглед, стандартни изследвания на кръв и урина и електрокардиограма и всички бяха установени, че са здрави. Прозрачно отчитане на оценката с блок схема на нерандомизирани дизайни, обобщаваща избора на тема, е представено на Фигура 1 .

бързото

Прозрачно отчитане на оценка с нерандомизирани схеми на диаграмата на изследването. Прегледани са четиринадесет субекта, от които 12 са записани, а 10 са завършили проучването. Двама участници завършиха интервенцията за отслабване като амбулаторни пациенти, а останалите участници завършиха като стационарни пациенти. WAT, бяла мастна тъкан.

Б. Размер на пробата

Основната крайна точка на това проучване е да се определи дали намесата значително ще промени плътността на CLS в подкожната мастна тъкан. Размерът на извадката се определя главно от съображения за логистика и осъществимост. Въпреки това, при 10 субекта, приемайки коефициент на вариация от 30%, сдвоеният t тест, приложен към тази проба, осигурява 80% мощност за откриване на размер на ефекта, малък като промяна в CLS/cm 2 от 1 единица от преди до след тегло загуба. Този размер на ефекта е еквивалентен на 30% увеличение спрямо изходната плътност на CLS.

В. Одобрение и регистрация на изпитанията

Проучването е одобрено от институционалните съвети за преглед в Университета Рокфелер, Медицинския колеж Weill Cornell и Центъра за рак на Memorial Sloan-Kettering и е регистрирано под идентификатора ClinicalTrials.gov> NCT01699906.

Г. Интервенции, събиране на проби и анализ

Ефектът на VLCD е оценен при субекти, след като са загубили приблизително 10% от телесното тегло. Диетата на всеки субект преди загуба на тегло е оценена от Харвардския въпросник за честотата на храната, който количествено определя приема на храна за период от 3 дни [18]. При постъпване в Университетската болница Рокфелер бяха събрани базови образци от проучването. Впоследствие участниците претърпяха 3-дневен период на корекция на диетата, консумирайки 50% от приемания им калориен прием. От 10-те субекта, завършили индуцираната от VLCD загуба на тегло, двама го направиха като амбулаторни пациенти с интензивно наблюдение, а осем като стационарни пациенти. Кръвните проби се взимат двуседмично за наблюдение на безопасността, което включва измервания на електролити и тестове за чернодробна функция. Скоростта на загуба на тегло не се различава значително между изследваните като амбулаторни или стационарни пациенти. След като загубиха приблизително 10% от изходното си телесно тегло, всички субекти консумираха VLCD в продължение на три допълнителни дни като стационари, през които всички измервания на изходното ниво бяха повторени. Кръв за анализи на крайни точки бяха събрани при гладно. Следователно всяка изследвана субект действаше като свой собствен контрол.

VLCD се състои от търговска диета (New Direction Program, Robard Corp., Mount Laurel, NJ), която осигурява приблизително 800 Kcal/d с приблизително разпределение на енергията на макронутриенти от 54% протеин, 26% въглехидрати, 20% мазнини (включително 4 % наситени мазнини и 200 mg холестерол) и 10 g/d фибри, както беше описано по-рано [19]. Този търговски препарат предлага избор на шейкове, супи, барове и пудинги. Субектите имаха четири възможности за избор на ден и консумираха по един артикул на всеки четири часа на будност.

Д. Измерване на F2-изопростан-М в урината

Анализът на F2-изопростан-М в урината беше извършен върху аликвотна част от 24-часово събиране на урина чрез течна хроматография-масспектрометрия в лабораторията на Eicosanoid Core на Университета Вандербилт, както е описано по-горе [20]. Нивата на F2-изопростан-М са нормализирани до креатинин.

F. Количествено определяне на CLS в проби за биопсия на мастна тъкан

CLS в пробите за биопсия на подкожна мастна тъкан на корема са количествено определени, както е описано по-горе [6]. Пробите за биопсия бяха фиксирани във формалин за 24 часа и след това вградени в парафинов блок. Шест секции бяха изрязани с разстояние от 50 μm; първата секция беше оцветена с хематоксилин и еозин (H&E), за да се гарантира, че пробата е представителна за мастната тъкан. Останалите пет среза бяха оцветени за макрофагичния маркер CD68 (миши моноклонални KP1 антитяло; разреждане 1: 4000; Dako, Glostrup, Дания), за да се идентифицира CLS чрез светлинна микроскопия. Броят на CLS на секция е записан от изследващия патолог (D.D.G.). Площта на мастната тъкан, изследвана във всяка от петте секции, беше измерена с помощта на софтуера Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD), за да се изчисли плътността на CLS като CLS/cm 2 .

G. Диаметър на адипоцитите

H & E оцветени секции бяха генерирани от проби за биопсия на подкожна мастна тъкан за измерване на диаметрите на адипоцитите, както беше описано по-рано [21, 22]. Оцветените H & E секции бяха заснети с увеличение × 20 с помощта на микроскоп Olympus BX50 (Orangeburg, NY) и цифрова камера MicroFire (Optronics Goleta, CA). Средните диаметри са изчислени, като се използват измервания от ≥30 отделни адипоцити за всеки пациент, като се използва инструментът за линейни размери в софтуера Canvas 11 (ACD Systems International Victoria, Канада).

H. Експресия на гени

Общата РНК се извлича от приблизително 0,5 g замразена мастна тъкан с помощта на мини комплект Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini (Germantown, MD). Качеството на РНК се оценява с помощта на биоанализатор Agilent. Приблизително, 2 до 3 μg РНК с номер на РНК интегритет> 7 бяха подадени за 50-bp сдвоено четене на РНК секвениране на обогатена с полиА РНК в Нюйоркския център за геноми. Експресията на гена се анализира за обогатяване на пътя, като се използва анализ на обогатяване на генетични набори (GSEA; Broad Institute, Кеймбридж, Масачузетс) и анализ на изобретателността на пътя (Qiagen).

За генериране на топлинна карта, гените бяха анотирани с помощта на библиотеката biomaRt в пакета R Bioconductor (https://www.bioconductor.org/). RNA-seq данните бяха нормализирани чрез регуларизирано логаритмично преобразуване в матрица чрез DESeq2 [23]. Алгоритъмът за анализ на вариацията на генни набори (GSVA) ​​[24] е приложен към матрицата, за да се определи количествено активността на пътя за набор от 1454 подбрани генни набора, налични в базата данни за молекулярни подписи. Бяха създадени контролирани топлинни карти за визуално сравняване на дейностите по пътеките преди и след пробите за загуба на тегло и за оценка на сходството на субекта и пътя. Приложен е линеен модел със смесени ефекти за оценка на средните стойности за активността на пътя преди и след загуба на тегло и за определяне на пътищата, които се различават значително между преди и след загуба на тегло VLCD. За да се постигне по-кратко визуално представяне, тези средни стойности бяха показани в топлинна карта (мащабирана по колона) въз основа на евклидово разстояние и пълен алгоритъм за свързване за йерархично групиране на пътеки.

I. Количествена верижна реакция на полимераза в реално време

Експресията на транскрипт се оценява, след като общата РНК се изолира от мастната тъкан, като се използва RNeasy Mini Kit (Qiagen). РНК (100 ng) беше обратно транскрибирана, използвайки qScript cDNA Synthesis Kit (QuantaBio Beverly, MA) и получената cDNA, използвана за усилване на полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време, използвайки Fast SYBR Green PCR master mix на 7500 HT в реално време PCR система (Applied Biosystems, Foster City, CA). IL-6 се амплифицира, като се използва анализ на праймера Qiagen QuantiTect (каталожен номер QT00083720). Праймери, използвани за усилване на фактор на туморна некроза-α, бяха: напред: 5′-CTG CAC TTT GGA GTG AT-3 ′; реверс: 5′-AGA TGA TCT GAC TGC CTG GG-3 ′. Праймери, използвани за усилване на IL-1β, бяха: напред: 5′-GGA CAA GCT GAG GAA GAT GC-3 ′; реверс: 5′-TCG TTA TCC CAT GTG TCG AA-3 ′. Експресията на транскрипт се нормализира до глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH), която се усилва с помощта на анализ на праймера Qiagen QuantiTect (каталожен номер QT00079247). Експресията се определя с помощта на протокола за анализ на ΔΔCT.

J. Статистически анализи

Използвани са двустранни сдвоени t тестове и тестове на Wilcoxon за сравняване на антропометрични измервания, биохимични променливи, серумни цитокини и имунохистохимични резултати преди и след индуцирана от VLCD загуба на тегло. P Таблица 1 показва средния състав на макроелементите на самоизбраните диети за предварително проучване на субектите и този на VLCD, консумиран по време на загуба на тегло. Ежедневният прием на протеин на VLCD (388 ± 45 Kcal протеин на ден) е подобен на диетата на субекта (382 ± 28 Kcal протеин на ден; P = не е значително), докато съдържанието на мазнини, въглехидрати и фибри е значително намалено.

маса 1.

Състав на диетата преди отслабване и VLCD