Системна микробиология

Тази статия е част от изследователската тема

Микробиом от насекоми: от разнообразие до приложения Вижте всички 22 статии

Редактиран от
Адли М. АБДАЛА

Лаборатория за контрол на насекомите, Съвместно подразделение на FAO/IAEA за ядрени техники в храните и селското стопанство, Международна агенция за атомна енергия, Виена, Австрия

Прегледан от
Мартин Калтенпот

Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

Хенри Дж. Огола

Jaramogi Oginga Odinga University of Science and Technology, Кения

Leen Van Campenhout

KU Ловен, Белгия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

frontiers

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente (DeFENS), Università degli Studi di Milano, Милано, Италия
  • 2 Изследователски център на Червено море (RSRC), Университет за наука и технологии King Abdullah (KAUST), Тувал, Саудитска Арабия
  • 3 Училище по приложни науки, Единбургския университет Нейпир, Единбург, Великобритания

Въведение

През последните години BSF микробиотата беше изследвана, като се вземат предвид различните етапи на развитие на гостоприемника и условията на хранене. Проучванията подчертават, че както диетата, така и етапът на живот са пряко повлияли на разнообразието на микробиотите (Jeon et al., 2011; Zheng et al., 2013b; Varotto Boccazzi et al., 2017; De Smet et al., 2018; Jiang et al., 2019; Wynants et al., 2019) и наскоро беше показано, че бактериалните съобщества варират в плътност и филогенетичен състав по предната, средната и задната част на средното черво (Bruno et al., 2019).

Материали и методи

Колония от насекоми

Hermetia illucens е отглеждан в ентомологичното съоръжение на Университета в Милано, Италия (Jucker et al., 2017). Хранени са ларви на BSF ad libitum на пълноценна хранителна диета (SD), съставена от пшеничен зародиш 50%, люцерна 30%, царевично брашно 20%, към която се добавя еднакъв обем вода според Hogsette (1992), при контролирани условия от 25 ° C и 60–65% относителна влажност (RH).

Дисекция на червата на личинките и бактериално изолиране

Идентификация на бактериите

Общата ДНК от всеки изолат се извлича чрез кипене на лизис (Ferjani et al., 2015) или с помощта на протокол за екстракция на ДНК на фенол-хлороформ (Sambrook et al., 1989) в случай на неуспех на 16S рРНК амплификация на PCR върху бактериална ДНК, екстрахирана съгласно кипяща лиза. Бактериалната колекция е премахната чрез ITS-PCR пръстови отпечатъци, като се използва двойката праймери ITS-F (5′-GTC GTA ACA AGG TAG CCG TA-3 ′) и ITS-Reub (5′-GCC AAG GCA TCC ACC-3 ′) ( Mapelli et al., 2013; Soldan et al., 2019). За всяка ITS група бяха избрани един/два кандидата и 16S rRNA генът беше амплифициран, използвайки праймерите 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3 ′) и 1492R (5′- CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA - 3 ′) (Mapelli et al., 2013; Soldan et al., 2019). PCR фрагментите бяха частично секвенирани в Macrogen (Южна Корея) и след това последователностите бяха подравнени спрямо базата данни EzBioCloud (Yoon et al., 2017). Последователностите бяха депозирани в Европейския нуклеотиден архив под номер за присъединяване PRJEB30516.

Скрининг на метаболитни дейности на бактериални изолати

За скрининг на амилаза бактериалните култури бяха забелязани върху NB агарова плака, допълнена с нишесте (1%) и след това инкубирани при 30 ° С в продължение на 48 часа. След инкубация плочите бяха наводнени с 1% разтвор на йод на Lugol (Jacob and Gerstein, 1960), за да се идентифицира извънклетъчната амилазна активност.

Провежда се скрининг на целулаза, както е описано от Ventorino et al. (2015) с използване на среда, съдържаща 0,1% [NH4] NO3, 0,1% екстракт от дрожди, 50 ml стандартен разтвор на сол, 1 ml разтвор на микроелементи (0,01% H3BO3, 0,012% MnSO4 H2O, 0,125% ZnSO4 7H2O, 0,078% CuSO4 5H2O, 0,01% MoO3), 0,5% CMC, 0,1% конго червено (Sigma-Aldrich) и 1,5% агар при рН 7. Пет микролитра течни бактериални култури, отглеждани през нощта в условия на разклащане при 30 ° С, бяха забелязани върху плаки и инкубирани при 30 ° С за 4 дни. След инкубация щамове с целулолитична активност показват ясни халогенни зони около колониите.

Скрининговата среда за пектиназа съдържа 0,67% азотна основа на дрожди, 1,0% пектин и 1,5% агар при pH 7,0 ± 0,2 (Park et al., 2007). След това плочите бяха обработени с 1% разтвор на н-хексадецилтриметиламониев бромид (CTAB) и разграждането на пектина беше оценено чрез наблюдение на ясен ореол около колониите.

Активността на естеразата се оценява, като се използва среда, съставена от 1,0% пептон, 0,5% NaCl, 0,01% CaCl2⋅2H2O, 1 ml твин 80 и 2,0% агар при pH 7,4 ± 0,2 (модифициран от Mazzucotelli et al., 2013). Образуване на бяла утайка около колониите, резултат от отлагането на кристали калциева сол, показва разтварянето на мастни киселини поради естеразната активност.

Активността на естераза/липаза се открива върху трибутиринова агарна среда, която съдържа 0,8% NB, 10 ml трибутирин, 4 ml между 20 и 1,5% агар при pH 7,5 ± 0,2. Трибутириновите агарови плаки с петнисти изолати се инкубират при 30 ° С в продължение на 72 часа. Прозрачната зона на хидролиза е показателна или за активността на естеразата и/или липазата, според Gupta et al. (2003).

Истинската активност на липазата се изследва от среда на родамин масло агар (ROA), съдържаща 0,8% NB, 0,4% NaCl, 3,125% маслиново масло, 10 ml родамин В (1 mg/ml разтвор) и 2% агар при pH 7, следвайки протокола описано от Kumar et al. (2012). След инкубация при 37 ° C в продължение на 48 h, положителните щамове бяха идентифицирани чрез образуването на оранжеви флуоресцентни ореоли около бактериални колонии под UV светлина.

Извънклетъчната протеазна активност се оценява, като се използва среда от млечен агар, съставена от 0,5% панкреатичен резорб на казеин, 0,1% глюкоза, 0,25% екстракт от мая, 3,5% обезмаслено мляко на прах и 1,5% агар (модифициран от Jeon et al., 2011). Плочите бяха изследвани след 72 часа инкубация при 30 ° С. Появата на ясна зона около петнистите изолати показва производството на извънклетъчна протеаза.

Производството на амоняк се оценява, както е описано от Cappuccino and Sherman (1992). Накратко, след инкубация през нощта при 30 ° С в TSB в разклащащо се състояние, 500 μl бактериална култура се инокулира в 10 ml пептонова вода и се инкубира при 30 ° С в продължение на 4 дни. След това към всяка култура се добавя 1 ml реактор на Неслер: развитието на оранжев цвят показва способността за щам да произвежда амоняк. Неинокулираната среда развива зелен цвят, както и бактерии без способност за производство на амоняк.

За да се открие разграждането на уреята, изолатите се инокулират в течна среда от триптичен соев бульон (TSB) и се инкубират една нощ при 30 ° С в състояние на разклащане; След това 0,5 ml култури се прехвърлят в епруветки от 1,5 ml и се промиват два пъти с 0,9% NaCl (5 минути, 4500 rpm, стайна температура), за да се отстрани остатъчната среда за растеж. Пелетите бяха ресуспендирани с 470 μl разтвор B (0.1% KH2PO4, 0.1% K2HPO4, 0.5% NaCl, 0.013% NiCl2, 1 mL фенол червено 0.2% и 100 mL dH2O) и 30 μl разтвор A (2 g карбамид, 2 mL етанол и 4 mL dH2O) и се инкубира при 30 ° C за 1-2 часа. След това беше проверен цветът: положителните щамове показаха промяна на цвета от жълт в ярко розов (модифициран от Mora et al., 2002).

Разграждането на пикочната киселина беше скринирано, като се наблюдава образуването на прозрачни ореоли около изолатите, забелязани върху NB-UA плаки (0.8% NB, 0.5% пикочна киселина и 1.5% агар), инкубирани в продължение на 48 часа при 30 ° C (модифициран от Morales-Jiménez и др., 2013).

Средата за скрининг на фитаза (PSM) съдържа 1% глюкоза, 0,4% Na-фитат, 0,2% CaCl2, 0,5% NH4NO3, 0,05% KCl, 0,05% MgSO4⋅7H2O, 0,001% FeSO4⋅7H2O, 0,001% MnSO4⋅H2O и 1,5 % агар при рН 7. Разграждането на Na-фитат се оценява след инкубация при 30 ° С в продължение на 4 дни. Наличието на ясни зони около изолатите, забелязани на плочи, се счита за индикация за разграждане на фитата (Jorquera et al., 2008).

Производството на екзополизахариди (EPS) е оценено според Santaella et al. (2008) с използване на RCV среда, модифицирана с добавяне на захароза (2%). Бактериалните щамове бяха набраздени върху агарови плочи с RCV среда и след 5 дни инкубация при 30 ° C, колониите, показващи полупрозрачен и мукоиден растеж, бяха счетени за положителни за производството на EPS.

Всички бактериални скрининги се провеждат в аеробни условия.

Бактериална администрация към диетата срещу насекоми

Bacillus licheniformis HI169 и Стенотрофомонадна малтофилия Клетките HI121 бяха администрирани H. illucens, единично или в комбинация. Лабораторният щам Ешерихия коли DH5α pKan (DsRed) е използван в опитите като контролен щам, външен човек на общността на коменсалите на BSF (Crotti et al., 2009). Щамовете HI169 и HI121 бяха инокулирани в триптична соева бульонна среда (TSB среда) и култивирани през нощта при 30 ° С, докато Е. coli DH5α pKan (DsRed) се инокулира в среда Luria Bertani (LB среда) и се култивира една нощ при 37 ° С. На следващия ден 5 ml от културите се инокулират в 100 ml подходяща среда за растеж и се инкубират в продължение на 24 часа. След растежа клетките се центрофугират при 3000 rpm в продължение на 15 минути при 4 ° С, супернатантите се изхвърлят и пелетите се промиват три пъти с физиологичен разтвор (NaCl 0.9%), за да се отстрани отработената среда. Събраните клетки се разреждат правилно до крайна концентрация от 10 8 cfu/ml във физиологичен разтвор.

За да се оцени всяко възможно антагонистично взаимодействие между щамовете, B. licheniformis HI169 и S. малтофилия HI121 се култивират на същата плоча. Накратко, един щам беше инокулиран с една единична ивица в средата на TSA плака и инкубиран в продължение на 48 часа при 30 ° С. След това три ивици от втория щам бяха направени перпендикулярно близо до предишния. Три репликирани плаки бяха приготвени за всеки щам. Ко-културите се инкубират при 30 ° С и се проверяват след 24 и 48 часа, за да се докаже инхибирането на растежа на щамовете.

Статистически анализ

За да се оценят разликите в ефективността на насекомите между обработките (нашата обяснителна категорична променлива; нива: Контрол, Е. coli DH5α pKan (DsRed), HI121, HI169 и HI121 + HI169) измерихме като променливи за непрекъснат отговор, растеж на ларвите, крайно тегло на ларвите, брой препупи, тегло на кученце и дължина на зеницата. За растежа на ларвите и появата на броя на препупите тествахме такива разлики, използвайки обобщаваща статистика на адитивния модел (GAM, пакет mgcv в 'r'; Wood, 2001), докато за крайното тегло на ларвите и теглото и дължината на кученцата, които направихме линеен смесен модел, където контролирахме факторната партида (използвайки пакета lmerTest в 'r'; Kuznetsova et al., 2015). За ANOVA анализа направихме сравнение по двойки, използвайки тест Tukey HSD. Всички статистически анализи бяха извършени в R (R Core Team, 2018).

Резултати

Бактериална изолация от BFS червата на ларвите

Фигура 1. Кръгови диаграми, представящи относителното култивируемо бактериално разнообразие, свързано с H. illucens ларви. Разнообразието на бактериите се изразява на ниво род (външен кръг) и семейство (вътрешен кръг).

В цялата колекция най-представени са родовете Провиденсия (22%) и Морганела (6%) от семейство Morganellaceae, Клебсиела (21%) и Ешерихия (7%) в семейството на Enterobacteriaceae, Acinetobacter (8%) от семейство Moraxellaceae, Stenotrophomonas (7%) от семейство Xanthomonadaceae, Псевдомонада (6) от семейство Pseudomonadaceae и Enterococcus (6%) в семейство Enterococcaceae (Фигура 1).

Хидролитични профили и производство на EPS

Всички 193 изолати са скринирани, за да се характеризира потенциалният принос на бактериалните партньори към усвояването на въглерод и азот в гостоприемника, както и да се изследва бактериалната способност да се придържа към чревния епител чрез производството на адхезивни вещества, т.е. EPS (Фигура 2 и допълнителна таблица 1).

Фигура 2. Метаболитни дейности и способност за производство на EPS за бактериалните изолати, получени от червата на H. illucens ларви. Баровете показват процентите на всеки бактериален клас по отношение на анализираната хидролитична активност и производството на EPS.

По отношение на разграждането на полизахаридите, открихме, че 15 от общо 193 изолати са в състояние да разграждат целулозата, 3 са амилолитични, докато 47 са пектинолитични бактерии. Способността за разграждане на липидите присъства сред изолатите: 21 от тях са в състояние да разграждат Tween 80, 26 да използват трибутирин и 44 са положителни за теста с истинска липаза върху плочи със зехтин. Като се имат предвид азотните диетични съединения, 175 изолати, 89% от колекцията щамове, успяват да произведат амоняк от пептиди, а 32 изолати могат да разграждат протеините. Потенциалният капацитет за рециклиране на азот от отпадъчни съединения от метаболитни насекоми е идентифициран в 63 и 31 изолати, което е положително за разграждането на уреята и пикочната киселина, съответно. Също така фокусирахме вниманието си върху наличието на фитазна активност в бактериалната колекция, която може да освободи бионаличен фосфат от диетичните компоненти: установихме, че 119 щама са положителни към скрининга за разграждане на фитатите.

Хидролитичните способности бяха широко разпространени в нашата колекция. Някои дейности са специфични за някои таксономични групи, т.е. пектинолитична активност за Клебсиела spp. и Stenotrophomonas spp. щамове (допълнителна таблица 1). Освен това няколко щама са показали множество хидролитични способности: 31% от изолатите са показали ≥ 4 активности и, сред тях, 13 щама са показали профил на многоактивност в резултат положителен за 5 или 6 дейности от 11-те, които сме извършили (допълнителна таблица 1) . И накрая, ние изследвахме способността на EPS да произвежда 59 положителни щама (30% от колекцията; Фигура 2).

Ние посочваме, че не всички бактериални изолати, получени от култури, обогатени за специфична разграждаща активност, показват очакваната ензимна активност, когато се тестват с помощта на специфични анализи на базата на плочи (допълнителна таблица 1). Това вероятно се дължи на изтичането на органични вещества от първоначалните хомогенати по време на процедурата на разреждане/фазите на обогатяване или на присъствието на спътници в обогатителните култури, способни да поддържат растежа на нехидролитичните.

Влияние на добавките на бактериални щамове върху развитието на ларвите

Сред 13-те изолати с по-голям брой метаболитни дейности, ние избрахме два щама, показващи синергични и допълващи способности под перспективата за изследване на потенциалния медииран от бактерии метаболитен принос към холобионта. Двата щама принадлежат към най-представените филогенетични групи в колекцията, т.е. Бацили и Гама-протеобактерии. Bacillus licheniformis HI169 показа способността да разгражда целулоза и нишесте, проявява уриколитична активност и успява да освободи амоняк, да разтвори между 80 и да произведе EPS. Стенотрофомонадна малтофилия HI121, обратно, може да смила казеин, да освобождава амоняк, да разгражда органичния фосфор, да разгражда пектин и да има липазна активност (допълнителна таблица 1). Не е открито инхибиране при директни антагонистични анализи на плочи между двата щама, потвърждаващи възможността за комбинирането им в опити за хранене (лечение „B. licheniformis HI169 + S. малтофилия HI121 ”). Следователно избраните щамове бяха приложени перорално, самостоятелно или в комбинация, на 9-дневни ларви на BSF, отглеждани на хранително лоша диета (FD) (Jucker et al., 2017): скорост на растеж на ларвите и крайно тегло, както както и външния вид на препупа, както и теглото и дължината на кученцата се наблюдават по време на цикъла на развитие на насекомите (Фигури 3, 4).

Фигура 3. Крайно тегло и темп на растеж на ларвите след бактериално приложение. (А) Крайното тегло на 10 ларви, отчетено в грамове, е показано за различните лечения. (Б) Скорост на растеж на 10 ларви на BSF, отглеждани на нестерилна диета на плодова основа със или без избраните бактериални щамове. Хоризонталната ос показва времето (дни), докато вертикалната ос отчита теглото на 10 ларви (грама). Контрол: нестерилна диета без избрани щамове; DH5α: ларви, хранени с външен щам на Е. coli DH5α pKan (DsRed); HI121: ларви, добавени с S. малтофилия щам HI121; HI169: ларви, допълнени с B. licheniformis щам HI169; Ларви HI169 + HI121, хранени с двата избрани щама.

Фигура 4. Тегло, дължина и външен вид на пупала след бактериално приложение. (А) Тегло на пупала и (Б) дължина са изобразени за различните лечения. (° С) Външният вид на препупа се отчита като прогресивни средни проценти в популацията на всяко лечение. Контрол: нестерилна диета без избрани щамове; DH5α: ларви, хранени с външен щам на Е. coli DH5α pKan (DsRed); HI121: ларви, добавени с S. малтофилия щам HI121; HI169: ларви, допълнени с B. licheniformis щам HI169; Ларви HI169 + HI121, хранени с двата избрани щама.

Бактериалната добавка се оказа значима при определяне на крайното тегло на ларвите (ANOVA, F4,10 = 16; стр Ключови думи: черна войнишка муха, валоризация на отпадъците, рециклиране на хранителни вещества, тегло на ларвите, тегло на кученце, бактериална изолация, пробиотици

Цитиране: Callegari M, Jucker C, Fusi M, Leonardi MG, Daffonchio D, Borin S, Savoldelli S и Crotti E (2020) Хидролитичен профил на полезната чревна бактериална общност, свързана с Hermetia illucens. Отпред. Микробиол. 11: 1965. doi: 10.3389/fmicb.2020.01965

Получено: 30 март 2020 г .; Приет: 24 юли 2020 г .;
Публикувано: 12 август 2020 г.

Adly M. M. Abdalla, Международна агенция за атомна енергия, Австрия

Хенри Джоузеф Одуор Огола, Университет за наука и технологии Jaramogi Oginga Odinga, Кения
Мартин Калтенпот, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия
Leen Van Campenhout, KU Льовен, Белгия