Редактиран от
Андрей Сургучов

Медицински център на Университета в Канзас, САЩ

Прегледан от
Дейвид Ръскин

Тринити Колидж, САЩ

Мустафа У. Имам

Университет в Джънджоу, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

подобрява

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по неврология, болница Хуашан, Университет Фудан, Шанхай, Китай
  • 2 Катедра по неврология, Шанхайската десета болница, Университет Тонджи, Шанхай, Китай
  • 3 Държавната ключова лаборатория по генно инженерство, Съвместен център за иновация за генетика и развитие, Училище за наука за живота, Университет Фудан, Шанхай, Китай
  • 4 Fudan University Taizhou Institute of Health Science, Taizhou, Китай

Заден план: Невропротективните ефекти на кетогенните диети (KD) са докладвани при модели на инсулт, а нуклеотид-свързващият домен (NOD) -подобен рецепторен протеин 3 (NLRP3) инфламазома също е замесен в патогенезата на инсулта. Това проучване има за цел да изследва ефектите на KD върху NLRP3 инфламазома и да изследва потенциалните молекулни механизми.

Методи: В in vivo проучване, мишките са били хранени с KD в продължение на 3 седмици и след това са били подложени на запушване/реперфузия на средната церебрална артерия (MCAO/R). В инвитро проучване, SH-SY-5Y клетките бяха третирани с β-хидроксибутират (BHB), последвано от лишаване от кислород-глюкоза/реоксигениране (OGD/R). Бяха оценени NLRP3 активиране на възпалителния инфаркт и свързаните с него регулаторни механизми.

Резултати: Мишките, хранени с KD, са имали повишен толеранс към MCAO/R. KD инхибира стреса на ендоплазмен ретикулум (ER) и потиска активирането на TXNIP/NLRP3 в мозъка. The инвитро проучване показва, че BHB (10 mM) предотвратява митохондриалната транслокация на свързания с динамин протеин 1 (Drp1), за да инхибира митохондриалното делене. Освен това BHB намалява генерирането на реактивни кислородни видове (ROS), инхибира ROS-NLRP3 пътя в клетки, третирани с OGD/R, и потиска предизвиканото от ER стрес-индуцирано NLRP3 активиране на инфламазома.

Заключения: KD може да потисне ER стреса и да защити митохондриалната цялост чрез потискане на митохондриалната транслокация на Drp1, за да инхибира NLRP3 активирането на възпаление, като по този начин упражнява невропротективни ефекти. Нашите открития предоставят доказателства за потенциалното приложение на KD за профилактика на исхемичен инсулт.

Въведение

Исхемичният инсулт, водеща причина за деструктивни цереброваскуларни заболявания, се характеризира с нарушен кръвен поток и лишаване от глюкоза/кислород на мозъчните клетки, което може да доведе до клетъчна дисфункция (Fisher and Saver, 2015). Съвременните лечения за исхемичен инсулт са ограничени поради неговите сложни молекулярни механизми (Barrett et al., 2015). Възпалението играе важна роля в патогенезата на исхемичния инсулт, а ролята на нуклеотид-свързващия домейн (NOD) -подобен рецепторен протеин 3 (NLRP3) инфламазома при инсулт е фокус в настоящите изследвания (Kawabori and Yenari, 2015). NLRP3 инфламазомата е молекулярна платформа, в която провъзпалителни цитокини (като каспаза-1 и интерлевкин-1β [IL-1β]) се активират, за да индуцират възпаление (Ogura et al., 2006). Беше потвърдено, че NLRP3 инфламазома се активира от началото на исхемичния инсулт (Fann et al., 2013b), а лечението, насочено към NLRP3 инфламазома, е обещаващо за лечение на инсулт (Yang et al., 2014).

При физиологично състояние NLRP3 обикновено се локализира в ендоплазмения ретикулум (ER). При активиране, NLRP3 и свързаният с апоптоза адаптер Speck-подобен протеин (ASC) се транслокират в перинуклеарното пространство, където се локализират заедно с ER и митохондриални клъстери от органели (Jo et al., 2016). Митохондриите са забележително динамични органели, които могат да се движат, разделят и сливат. Циклите на митохондриално делене и сливане осигуряват нормални метаболитни и биоенергийни функции (Bertholet et al., 2016). Митохондриалното делене може да предизвика NLRP3 инфламазома при инфекция с РНК вирус, при което свързаният с динамин протеин1 (Drp1), ключов регулатор на митохондриалното делене, играе важна роля (Rayamajhi и Miao, 2014). Нашето предишно проучване разкри, че Drp1, преместващ се в митохондриите, медиира митохондриалното делене, а фармакологичното инхибиране на транслокацията на Drp1 предотвратява фрагментацията на митохондриите, като по този начин защитава невроните от увреждане, причинено от лишаване от кислород и глюкоза (OGD) (Zhao et al., 2013) Механизмът, чрез който Drp1 регулира NLRP3-медиирано възпаление при исхемичен инсулт, остава неясен.

След исхемия новосинтезираните протеини се натрупват, за да увеличат разгънатата протеинова реакция (UPR). Тежкото и продължително UPR може да предизвика ER стрес. ER сензорът за стрес IRE1a може да индуцира взаимодействащ с тиоредоксин протеин (TXNIP), за да активира медиирано от NLRP3 възпаление и програмирана клетъчна смърт (Lerner et al., 2012). Реактивните кислородни видове (ROS), генерирани от митохондриално делене, могат да активират NLRP3 инфламазома, за да влошат ER стреса, което допълнително влошава морфологията и функцията на митохондриите (Minutoli et al., 2016). Установено е също така, че потискането на ER стрес и/или генериране на ROS облекчава медиираното от NLRP3 възпаление при инсулт.

Нарушаването на кръвния поток и/или намаляване на концентрацията на глюкоза в кръвта при исхемичен инсулт може да причини мозъчно увреждане. Кетонните тела (KB), които включват ацетоацетат и β-хидроксибутират (BHB), могат да служат като алтернативни субстрати на глюкозата в мозъка. BHB е основен член на KB. Той се генерира от окисляване на мастни киселини и може да се превърне в BHB чрез кетогенеза в чернодробните митохондрии. Установено е, че кетогенната диета (KD) или BHB подобрява мозъчния оток и обема на инфаркта след инсулт (Suzuki et al., 2001). Освен това BHB може да предотврати невронална смърт, предизвикана от лишаване от глюкоза или хипоксия (Camberos-Luna et al., 2016). Последните проучвания също разкриват, че BHB е в състояние да потисне активирането на NLRP3 възпалително в човешки хепатомни HepG2 клетки и моноцити (Youm et al., 2015; Bae et al., 2016). Ролята на KBs в регулацията на NLRP3 инфламазома в централната нервна система след исхемия обаче остава неизвестна.

В това проучване ефектите на KD и BHB върху NLRP3 инфламазома са изследвани при мишки с оклузия на средната церебрална артерия (MCAO) и SH-SY-5Y, подложени на OGD/реоксигенация (OGD/R), съответно и потенциалният механизъм е допълнителен проучени. Нашите резултати разкриха, че KD и BHB са успели да подобрят церебралната исхемия чрез инхибиране на NLRP3 активиране на възпалението, което се дължи на потискането на медиираното от Drp1 митохондриално делене и инхибирането на ER стреса.

Материали и методи

Животни и диетични протоколи

Мъжки мишки C57BL/6 (на възраст 4 седмици) бяха настанени в Експерименталния център за животни на Университета Фудан при 26 ° C с 12 h/12 h цикли светлина/тъмнина и им бяха дадени ad libitum достъп до храна и вода. Мишките бяха разпределени на случаен принцип в четири групи: контролна група (мишките бяха хранени със стандартна чау [Teklab, 8664]); Група KD (мишките са хранени с диета с високо съдържание на мазнини и ниско съдържание на въглехидрати [ResearchDiets, D12369B]); диетична група с високо съдържание на въглехидрати (HC) (мишките бяха хранени с ниско съдържание на мазнини, HC диета [ResearchDiets, D12359]); Група CP-456773 (мишки получават единична доза перорално CP-456773 [50 mg/kg, NLRP3 инхибитор на инфламазома, Sigma PZ0280] в продължение на 3 седмици със стандартна чау). Мишките бяха хранени с назначени диети (съставът от три диети е показан в таблица 1) в продължение на 3 седмици. Преди рандомизацията, мишките от всяка група са гладували в продължение на 18 часа, за да стабилизират нивото на кръвната глюкоза и да инициират състояние на кетоза. Всички процедури бяха извършени в съответствие с Ръководството за Националния научен съвет на Китайската народна република. Изследването е одобрено от Комитета по етика на университета Фудан, Шанхай, Китай. Номерът на одобрение от IRB е „20150572A259“. Този ръкопис е написан в съответствие с Animal Research: Reporting in vivo Насоки за експерименти (ПРИХОДЯТ).

маса 1. Състав на макроелементите на диетите на мишки, използвани в това проучване.

Създаване на модела MCAO

Мишките са упоени чрез интраперитонеално инжектиране на кетамин при 65 mg/kg и ксилазин при 6 mg/kg. В дясната средна церебрална артерия (MCA) се поставя покрита нишка за 45-минутна оклузия, последвана от реперфузия. По време на операцията телесната температура се поддържа на 37 ° C, като се използва нагревателна подложка и система за контрол на обратната връзка (Bowdoin, ME, САЩ). Лазерна доплер сонда беше поставена върху черепа (5 mm странично и 2 mm отзад на брегмата) за наблюдение на мозъчния кръвен поток (CBF). Мишки с 3 клетки/ямка). Накратко, 20 μl разтвор на МТТ (5 mg/ml) се добавят към всяка ямка при крайна концентрация от 0,5 mg/ml, последвано от инкубация в продължение на 4 часа. Супернатантата се отстранява и към всяка ямка се добавят 150 μL разтвор на диметилсулфоксид, последвано от инкубация в продължение на 20 минути. Абсорбцията е измерена при 570 nm с референтна дължина на вълната при 630 nm. Експериментът е направен в три екземпляра.

Измерване на АТФ

Генерирането на АТР се открива чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), както беше съобщено по-рано (Cui et al., 2010). Накратко, хранителната среда се отстранява от клетките и веднага се добавя течен азот. След изпаряване върху лед, към всяка ямка се добавят 300 μL ледено студена 0,4 М перхлорна киселина. Клетките бяха събрани и центрофугирани при 14 000 ж за 15 минути при 4 ° С. Супернатантата се неутрализира с 1 М K2CO3, поддържа се при -80 ° С, за да се утаи перхлоратът и след това се центрофугира. Супернатантата се събира за HPLC. Използвани са 12-канален CoulArray 5600A (ESA Inc.) и колона с обратна фаза (Lichrospher-100, Merck). Сигналите бяха открити с помощта на UV детектор (# 526, ESA Inc.) при 260 nm и преобразувани от CoulArray Analog Input Adapter преди анализ с помощта на софтуера CoulArray ®. Всички пикови области бяха в линейния диапазон на стандартните криви.

Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана

Потенциалът на митохондриалната мембрана (MMP; ψψm) се определя чрез конфокална микроскопия след оцветяване с тетраметилродамин етилов естер (TMRE), както е описано по-рано (Zhao et al., 2013). След третиране, SH-SY-5Y клетки се инкубират с TMRE (крайна концентрация: 50 пМ) в продължение на 20 минути при 37 ° С. Флуоресценцията беше открита с помощта на поточната цитометрична система BD FACS Canto ™ II (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Неклетъчните отломки и мъртвите клетки бяха затворени навън и

30 000 събития бяха събрани за анализ. Клетките се обработват с 20 цМ карбонил цианид 4- (трифлуорометокси) фенилхидразон (FCCP) в продължение на 20 минути до колапс Δ m и получената TMRM флуоресценция се използва за определяне на прага. Данните се изразяват като процент на клетките със сигнал над този праг.

ROS анализ

SH-SY-5Y клетки при 80% сливане се третират, както е споменато по-горе. След това клетките се измиват с PBS и се инкубират с ROS флуоресцентна сонда-DHE (енергична биотехнология, Пекин, Китай) в продължение на 30 минути при 37 ° С. След трикратно измиване със студен PBS, флуоресценцията беше измерена с помощта на четец на микроплаки при дължина на вълната на възбуждане 485 nm и дължина на вълната на излъчване 525 nm.

Оценка на митохондриалната морфология

Клетките SH-SY-5Y се отглеждат върху покрити с покритие с поли-D-лизин. Митохондриите са етикетирани с DsRed-Mito (1 μg на 60-милиметрова чиния, Clontech, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. След това клетките бяха фиксирани с 4% параформалдехид и покривните стъкла бяха монтирани с помощта на Prolong Gold Antifade Reagent с DAPI (Invitrogen). Изображенията са заснети с помощта на обърнат епифлуоресцентен микроскоп (Олимп, Токио, Япония). Клетките с преобладаващо непокътната мрежа от тръбни митохондрии бяха идентифицирани като нормални. Клетките с нарушени и предимно сферични митохондрии бяха идентифицирани като такива с митохондриално делене. Размерът и формата на митохондриите се определят количествено по заслепен начин, като се използва ImageJ (NIH изображение).

Drp1 Транслокация

Клетките SH-SY-5Y бяха използвани за изследване на транслокацията на Drp1. Клетките се култивират на покрити с поли-D-лизин покривни стъкла и се трансфектират с 1 μg DsRed-Mito и 1 μg Drp1-myc. След OGD, клетките бяха фиксирани и имунооцветени с анти-myc антитяло и след това с вторично антитяло AlexaFluor 488 (Invitrogen). Изображенията бяха заснети и анализирани чрез конфокална микроскопия. Около 60 клетки бяха анализирани на група в четири независими експеримента.

Митохондриална изолация

Митохондриите бяха изолирани с помощта на комплект за изолиране на митохондрии (Pierce, Rockford, IL, USA) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, SH-SY-5Y клетки се хомогенизират в хомогенизатора Dounce и след това се центрофугират при 750 ж за 10 минути при 4 ° С. Супернатантът беше допълнително центрофугиран при 12 000 ж в продължение на 15 минути при 4 ° С и след това пелетата се промива и задържа като митохондриална фракция.

Имуносорбентен анализ, свързан с ензими (ELISA)

Мозъчните тъкани (мозъчните области, доставени от MCA) се събират след лечение и се изплакват с 1 × PBS. За анализ на активността на каспаза-1 мозъчните тъкани се хомогенизират в лизисен буфер (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA), последвано от центрофугиране при 10000 ж за 10 минути и след това супернатантата се събира. За инвитро експерименти, бяха събрани около 5 × 106 клетки, суспендирани в 50 μl буфер за предварително студено лизиране, инкубирани върху лед за 10 минути и след това центрофугирани при 10 000 ж за 1 min и супернатантата се събира. Концентрацията на протеин в супернатантата се определя чрез Брадфорд. Комплект за флуорометричен анализ на Caspase-1 (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) е използван за откриване на активността на caspase-1, съгласно инструкциите на производителите. Определена е гъвкавата промяна във флуоресценцията (активност на каспаза-1) в сравнение с тази в контролната група.

За измерване на IL-1β, мозъчните тъкани (мозъчните области, доставени от MCA) се хомогенизират в 20 ml 1 × PBS и се събира лизатът. Освен това, за измерването бяха събрани и среди за клетъчни култури. Пробите се центрофугират при 5000 ж за 5 минути и супернатантата се събира. Концентрацията на IL-1β се измерва, като се използва набор от ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) на RayBio ® Human IL-1 β (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Абсорбцията при 450 nm беше измерена веднага след добавяне на стоп разтвор.

Западно петно

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Сравненията бяха направени с еднопосочен или двупосочен ANOVA, последван от Newman-Keuls post hoc тестване за двойни сравнения. Статистическият анализ беше извършен с помощта на SPSS версия 22 (IBM, Armonk, NY, USA). Стойност на P # P # P # P 2/4π площ. Аспектното съотношение е измерване на големи/малки оси. И двете стойности се доближават до 1, тъй като частицата става по-кръгла. Количественото определяне беше извършено от 10 до 15 произволно избрани клетки в три независими експеримента. Данните са показани като средно ± SEM; *P # P # P # P # P # P # P Ключови думи: кетогенна диета, β-хидроксибутират, митохондриално делене, стрес от ендоплазмен ретикулум, NLRP3 инфламазома, Drp1

Цитиране: Guo M, Wang X, Zhao Y, Yang Q, Ding H, Dong Q, Chen X и Cui M (2018) Кетогенна диета подобрява мозъчната исхемична толерантност и инхибира активирането на възпалителния NLRP3 чрез предотвратяване на медиирано от Drp1 митохондриално делене и стрес на ендоплазматичния ретикулум . Отпред. Мол. Невроски. 11:86. doi: 10.3389/fnmol.2018.00086

Получено: 29 ноември 2017 г .; Приет: 05 март 2018 г .;
Публикувано: 20 март 2018 г.

Андрей Сургучов, Медицински център на Университета в Канзас, САЩ

Мустафа Умар Имам, Университет в Джънджоу, Китай
Дейвид Ръскин, Тринити Колидж, САЩ

† Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.