VH Tournas

1 Център за безопасност на храните и приложно хранене, Администрация по храните и лекарствата, College Park, MD, САЩ.

гъбично

Н. С. Ниази

2 Медицинско училище в Университета Geogetown, Вашингтон, окръг Колумбия, САЩ.

JS Kohn

3 Североизточна регионална лаборатория, Администрация по храните и лекарствата, Ямайка, Ню Йорк, САЩ.

Резюме

Шестдесет и четири проби от дървесни ядки (бадеми, пекани, кедрови ядки и орехи) и 50 проби от сушени плодове (кайсии, червени боровинки, папая, ананас и стафиди) бяха закупени от местните супермаркети и анализирани за замърсяване с гъбички с помощта на конвенционална култура, както и молекулярни методи. Резултатите от нашето проучване показаха, че най-високият брой дрожди и плесени (YM) (5,34 log10 CFU g -1) е открит при орехите, а най-нисък при пеканите. Най-често срещаната плесен в ядките е Aspergillus niger, относително нисък брой A. flavus е открит навсякъде, докато Penicillium spp. са били много често срещани в кедровите ядки и орехите. Ниски нива (2.00–2.84 log10 CFU g -1) на дрожди бяха открити само от две проби от борови ядки. Гъбичното замърсяване в сушените плодове е минимално (вариращо от -1). Най-високите нива на гъбички присъстват в стафидите. Всички проби от папая и по-голямата част от пробите от червена боровинка, ананас и кайсия не съдържат живи гъби. Най-често срещаната плесен в сушените плодове е A. niger, последвана от Penicillium spp. Една проба от кайсии също съдържа ниски нива (2,00 log10 CFU g -1) на дрожди.

Въведение

Материали и методи

Материали

Изсушените в това проучване сушени плодове и дървесни ядки са получени или в неотворени опаковки, или от насипни буркани и тави (порции от 1 lb) от четири вериги супермаркети (осем магазина) в района на Вашингтон, окръг Колумбия; всяка проба е взета от отделна партида. Всички проби се съхраняват при стайна температура от момента на закупуването до началото на анализа, който се провежда в рамките на 48 часа от момента на закупуването. Петдесет грама от всяка проба бяха анализирани за гъбично замърсяване.

Химикали, реактиви и други доставки

Реагентите с полимеразна верижна реакция (PCR) и ДНК стълба са закупени от Fisher Scientific. ДНК комплекти за екстракция са получени от Norgen Biotek Corporation; праймери са закупени от Integrated DNA Technologies (IDT). Агарозните гелове са получени от Bio-Rad. Всички микологични среди, използвани за изолиране и конвенционално идентифициране на покритие на гъбични проби, са били приготвени вътрешно в съответствие с методите и формулите, описани от Pitt and Hocking15 и в Бактериологичния аналитичен наръчник.

Изолиране и количествено определяне на плесени и дрожди

Пробите бяха тествани, както следва: Петдесет грама от всеки продукт бяха асептично прехвърлени в стерилни бурканчета за блендер. Впоследствие те се смесват в 450 ml 0,1% пептон за 45 секунди. Серийните разреждания на хомогенатите в 0,1% пептон се нанасят на повърхността върху дублиран агар DG18 (0,1 ml/плато) и плочите се инкубират в продължение на 5 дни при 25 ° С. След това се преброяват колонии и се отчитат като образуващи колонии единици на грам (CFU g -1).

Спецификация на изолирани гъбични щамове

Възстановените изолати се пречистват чрез повторно събиране на плочи от картофен декстрозен агар (PDA) (DIFCO) и се идентифицират на ниво род или вид, като се използват конвенционалните методи и ключове, описани в Идентификация на обикновени видове Aspergillus, Лабораторно ръководство за обикновени видове Penicillium, Fusarium Species: Илюстрован наръчник за идентификация и разваляне на гъби и храни.

Молекулярен метод - екстракция на ДНК

Гъбичната ДНК се изолира, както следва: Гъбичните щамове, извлечени от дървесни ядки и сушени плодове, се отглеждат на твърда среда при 25 ° С в продължение на 5 дни; след това малка част от културата от всеки изолат се прехвърля в 15-милилитрова конична епруветка, съдържаща бульон от картофена декстроза и се инкубира при 30 ° С в продължение на 24 часа. След инкубационния период културите се центрофугират в продължение на 10 минути при 10 000 rpm до пелети и супернатантите се изхвърлят. Впоследствие към всяка епруветка се добавят 10 ml буфер с фосфатен буфер (PBS) и пелетите се хомогенизират чрез завихряне. Епруветките се центрофугират отново при същите условия, както по-горе, и супернатантите се изхвърлят. След това към всяка проба се добавят 1 mL PBS буфер и епруветките се завихрят. Впоследствие 50 μl се отстраняват от всяка епруветка и се прехвърлят в 2,0 ml епруветки за микроцентрифугиране, за да се продължи с ДНК екстракция. ДНК екстракцията се извършва с помощта на комплект за изолиране на генетични ДНК Norgen Biotek Fungi/Yeast, съгласно инструкциите на производителя.

Полимеразна верижна реакция

Използвани са праймерите, кодиращи гена на β-тубулин, Bt2a (5′-GTAACCAAATCGGTGCTGC TTTC-3 ′) и Bt2b (5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3 ′) .20 Методът, описан от Asefa и сътр. PCR се извършва в реакционни епруветки с краен обем от 50 μL, състоящ се от 25 μL безцветен главен микс Promega GoTaq Hot Start, 21,5 μL вода без нуклеаза Promega, 1,5 μL ДНК шаблон и 1 μL от всеки праймер. Сместа се върти и PCR реакцията се провежда в термоциклер Eppendorf 2231 (Eppendorf Северна Америка), програмиран при следните условия: Денатурация при 95 ° C за 10 минути, 38 цикъла на денатурация при 95 ° C за 30 секунди, отгряване 55 ° C за 30 секунди, удължаване при 72 ° C за 1 минута и окончателно удължаване при 72 ° C за 7 минути.

Гел електрофореза

PCR продуктите се подлагат на електрофореза в 1% агарозни гелове (Bio-Rad ReadyAgarose етидиев бромид сглобяеми гелове), за да се определят размерите на лентата и да се потвърди амплификацията на ДНК. Геловете се пускат с използване на буфер Tris-borate-EDTA (TBE) при 60 V за 70 минути и впоследствие се визуализират и снимат под UV светлина в Alpha Imager (Alpha Innotech Corp.).

Последователност и идентификация на видовете

Пречистването и секвенирането на PCR продуктите се извършва от MCLAB и получените последователности се изрязват и редактират с помощта на софтуера FinchTV 1.4.0. Впоследствие бяха направени сравнения на последователности и спецификации чрез използване на основния инструмент за локално търсене на подравняване (BLAST) в Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Резултати

Гъбично замърсяване в дървесните ядки

В това проучване бяха тествани 64 проби от дървесни ядки (състоящи се от пекани, бадеми, кедрови ядки и орехи) за наличие и нива на гъбични замърсители. Всички проби от орех, 91% от кедрови ядки и 76% от бадемови проби съдържат живи гъби. Честотата на мухъл е много ниска (6%) при пеканите. Най-високият брой на дрождите и плесените (YM) (5,34 log10 CFU g -1) беше открит от орехите, а най-ниските нива (2,00 log10 CFU g -1) бяха открити в пеканите (Таблица 1).

маса 1

Нива на гъбично замърсяване в различни ядки и сушени плодове.

ПРОДУКТ БРОЙ ПРОБИ ТЕСТИДИМ БРОЙКИ ОБХВАТ (log10 CFU g -1) ЧЕСТОТА *
Ядки
Бадеми17 * Честотата е процентът на замърсени проби.

Съкращения: YM, мая и плесен; CFU, единици, образуващи колонии.

Таблица 2

Гъбични видове и нива, възстановени от избрани дървесни ядки.

ОРГАНИЗМ КОНТАМИНАЦИОННИ НИВА (log10 CFU g -1 - ОБХВАТ)БАДЕМИ (n = 17) ПЕКАНИ (n = 16) БОРОВИ ЯДКИ (n = 11) ОРЕХИ (n = 20)
Alternaria spp. Таблици 1 и и 3. 3. От тестваните 50 проби от сушени плодове само 25% от кайсиите, 20% от боровинките, 8% от ананаса и 60% от стафидите са били замърсени с живи гъби. От папая не са изолирани живи плесени или дрожди. Нивата на YM в първите три стоки бяха ниски (2,60 log10 CFU g -1 или по-ниски); стафидите обикновено носят по-висок брой YM, достигайки 3,86 log10 CFU g -1 (Таблица 1). Основният замърсител на стафидите е A. niger, открит в 50% от пробите, докато A. tubingensis е възстановен от ананас и ниските нива на пеницилия са изолирани от кайсии и боровинки (Таблица 3).

Таблица 3

Гъбични видове и нива, възстановени от различни сушени плодове.

ОРГАНИЗМ КОНТАМИНАЦИОННИ НИВА (log10 CFU g -1 - ОБХВАТ)КАЙСИИ (n = 8) ЧЕРВИНИ (n = 10) ПАПАЯ (n = 10) АНАНАС (n = 12) СТЕНИШИ (n = 10)
Aspergillus nigerNDNDNDND -1. AFB1 и AFB2 са произведени от някои щамове A. flavus и A. parvisclerotigenus, докато AFB1, AFB2 AFG1 и AFG2 са разработени от всички изолати на A. nomius и A. parasiticus. Bayman et al., 1 след тестване на 1100 проби от дървесни ядки (включително бадеми, шам-фъстъци, орехи и бразилски ядки) без видими увреждания от насекоми, също съобщават, че най-често срещаните плесени в тези стоки са Aspergillus, Penicillium и Rhizopus. Практиките за прибиране на реколтата и след прибиране на реколтата изглежда засягат микофлората на ядките. Rodrigues et al6 тестваха бадеми за наличие на плесени от Flavi от Aspergillus. Тези изследователи съобщават, че A. parasiticus е най-честата, включваща 56% от изолатите, следвана от A. flavus (36% от изолатите) и Aspergillus tamarii (8% от изолатите). Двадесет и осем процента от щамовете на A. flavus произвеждат AFB, докато 100% от A. parasiticus изолира разработени AFB и AFG.

Нашето проучване разкри наличието на потенциално токсигенни плесени A. niger, A. flavus, Penicillium spp. и P. polonicum в кедрови ядки при нива по-високи от 3,00 log10 CFU g -1. Гъбично замърсяване на кедрови ядки също се съобщава в минали проучвания. Weidenborner23 определя, че доминиращите гъбични замърсители на кедровите ядки са Cladosporium (37% от изолатите), последван от Phoma (19% от изолатите), и че 16 от 31 изолирани вида (включително Alternaria alternata, Aspergillus versicolor, A. niger, Eurotium chevalieri, Penicillium aurantiogriseum, P. viridicatum, P. citrinum, P. crustosum, P. puberulum, P. expansum, P. glabrum и Trichothecium roseum) са потенциално токсигенни. Marin et al, 24, от друга страна, съобщават за наличието на Fusarium proliferatum в кедрови ядки. Петдесет и четири процента от щамовете F. proliferatum, изолирани от тези изследователи, произвеждат фумонизин В1 (FB1) в черупкови борови ядки, докато 18% изработват същия токсин в цели кедрови ядки в лабораторно проучване. По време на нашето проучване в тази стока не са открити живи фузарии.

Според резултатите от нашето проучване, най-честите плесени, открити в орехите, са пеницилиите (включително P. brevicompactum, P. crustosum P. solitum, P. glabrum и P. hispanicum), A. tubingensis, A. niger и A flavus. Fusarium spp. са изолирани само от 3 от 20 проби. Минали изследвания на гъбично замърсяване на орехи показват подобни профили на микрогъбички. Abdel-Hafez и Saber9 съобщават, че A. flavus, A. niger, A. fumigatus, Cladosporium spp., Penicillium chrysogenum и P. oxalicum са най-честите замърсители, докато Fusarium verticillioides, F. equiseti и F. oxysporum са по-малко често срещан в орехите в Египет. Bacchetti и Arp, 25, от друга страна, съобщават за изолирането на щам P. crustosum от плесенясали орехи; този изолат е успял да произведе пенитрем А токсин.

В нашето проучване пеканите са имали минимално гъбично замърсяване. Това е в контраст с минали проучвания, които съобщават за наличието на различни замърсители на плесени в пеканите с потенциал да произвеждат микотоксини.11,26 Schroeder и Hein11 демонстрират наличието на A. flavus (открит в 43% от пробите) и A. glaucus ( срещани в 35% от тестваните проби) в пекани в черупки; за тези организми е известно, че произвеждат ST. Trucksess et al, 26, от друга страна, съобщават, че някои щамове A. flavus и A. tamarii, изолирани от пекани, са способни да произвеждат циклопиазонова киселина (CPA). Пропиленовият оксид (PO) или друго (и) фунгицидно (и) лечение (и), приложено (и) върху пекани след прибиране на реколтата, може да е отговорно за ниските нива на YM, установени в нашето проучване. Blanchard и Hanlin27 демонстрират, че прилагането на PO е причинило унищожаването на 80% –92% от повърхностните микроорганизми.

Заключения

От резултатите от нашето проучване и миналата литература е очевидно, че замърсяването с мухъл и микотоксини на ядки и стафиди е постоянен проблем. Мерките за намаляване на броя на спорите на гъбички, пренасяни по лозовите плодове и ядките от овощната градина, както и спазването на добрите производствени практики (GMP) по време и след прибиране на реколтата и бързото изсъхване са от съществено значение за предотвратяване или минимизиране на растежа на плесени и замърсяването с микотоксини в изсушеното продукти. Освен това, за да се запази качеството на тези стоки, продуктите трябва да се съхраняват при условия, които осигуряват поддържане на подходящи нива на влага по време на съхранението и пускането на пазара. Тъй като ядките съдържат много ниски нива на разтворими въглехидрати, малко повишаване на съдържанието на влага (напр. Кондензация поради температурни промени по време на транспортиране и съхранение) може да доведе до значително увеличаване на aw. Увеличаването на aw над определено ниво ще насърчи растежа на някои гъбични видове, което може да причини разваляне и евентуално да произведе микотоксини.

Ниското замърсяване с мухъл в пеканите и някои сушени плодове може би отразява използването на някакъв вид фунгицидно третиране след прибиране на реколтата и преди съхранение и пускане на пазара (напр. ПО или нанасяне на топлина). Ако се прилага такова инактивиращо плесента лечение, всички микотоксини или странични продукти от разваляне, образувани преди това лечение, най-вероятно ще продължат да бъдат активни и опасни за човешкото здраве. Следователно бъдещите проучвания трябва да бъдат насочени към тестване и установяване на микологични профили на тези стоки, като се използват проби, събрани преди прилагането на обработка за унищожаване на плесени.

Благодарности

Авторите са благодарни на Евгения Кацудас (Служба за регулаторни въпроси/FDA) и Карол Уивър (Център за безопасност на храните и приложно хранене/FDA) за техническата им помощ по време на подготовката на ръкописа.

Бележки под линия

АКАДЕМИЧЕН РЕДАКТОР: Раул Ривас, главен редактор

ФИНАНСИРАНЕ: Тази работа беше подкрепена единствено от фондове на FDA. Авторите потвърждават, че финансиращият не е оказал влияние върху дизайна на изследването, съдържанието на статията или подбора на това списание.

КОНКУРЕНТНИ ИНТЕРЕСИ: Авторите не разкриват потенциален конфликт на интереси.

Документ, подлежащ на независим експертен сляп партньорски преглед от минимум двама рецензенти. Всички редакционни решения, взети от независим академичен редактор. При изпращане ръкописът е подложен на антиплагиатско сканиране. Преди публикуването всички автори са дали подписано потвърждение на съгласието за публикуване на статията и спазването на всички приложими етични и правни изисквания, включително точността на информацията за автора и сътрудниците, разкриване на конкуриращи се интереси и източници на финансиране, спазване на етичните изисквания, свързани с хората и животните участниците в проучването и спазването на изискванията за авторски права на трети страни. Това списание е член на комисията по публикационна етика (COPE).

Принос на автора

Извършени експерименти: VHT, NSN. Планира експериментите и написа и редактира ръкописа: VHT. Съдейства за редактиране на ръкописа: JSK. Всички автори допринесоха за обсъждане на резултатите и прегледаха и одобриха окончателната версия на ръкописа.