Гелната електрофореза се използва най-често за разделяне и пречистване на протеини и нуклеинови киселини, които се различават по размер, заряд или конформация.

електрофореза

Свързани термини:

  • Ензим
  • Протеин
  • Фенотип
  • Мутация
  • ДНК
  • РНК
  • Полимеразна верижна реакция
  • Алел

Изтеглете като PDF

За тази страница

Гел Електрофореза

Резюме

Електрофорезата е техника, която позволява разделяне и анализ на заредени молекули в електрическо поле. Гелната електрофореза се използва най-често за разделяне и пречистване на протеини и нуклеинови киселини, които се различават по размер, заряд или конформация. Гелът е съставен от полиакриламид или агароза. Агарозата е подходяща за разделяне на ДНК фрагменти с размер от няколкостотин базови двойки до около 20 kb. Полиакриламидът е предпочитан за протеини и по-малки фрагменти на ДНК. Подвижността на ДНК е постоянна при определени електрофоретични условия. Тези условия се характеризират с електрическите параметри (ток и напрежение) и фактори като буферен състав, концентрация на агароза и температура.

Биофизични, химични и функционални сонди за РНК структура, взаимодействия и сгъване: Част А

Дурга М. Чадалавада, Филип С. Бевилаква, в Методи в ензимологията, 2009

Гел електрофорезата е повсеместна техника за разделяне в биохимията на нуклеиновите киселини. Денатуриращата гел електрофореза разделя нуклеиновите киселини на базата на дължината, докато естествената гел електрофореза разделя нуклеиновите киселини както на формата, така и на дължината. Гел електрофореза с температурен градиент (TGGE), при която температурен градиент присъства в гела, съчетава предимствата на денатуриращата и естествената гел електрофореза, като притежава естествени гелоподобни свойства при ниски температури и денатуриращи гелоподобни свойства при високи температури. Тук описваме техниките на перпендикулярно и паралелно TGGE и някои от техните приложения. Изолирането на стабилни и нестабилни РНК и ДНК последователности от комбинаторни библиотеки се осъществява с TGGE-SELEX, докато термодинамичната характеристика на третичен мотив на РНК се извършва чрез перпендикулярни TGGE-стопилки. За илюстриране на методите от литературата са избрани конкретни примери. TGGE предоставя мощен биофизичен подход за анализ на РНК и ДНК, който допълва по-традиционните методологии.

ЕЛЕКТРОФОРЕЗА | Протеини

Физикохимична характеристика

Анализ на гликани; Функционални свойства на полизахаридите

2.12.2.3 Капилярна гел Електрофореза

Капилярна гел електрофореза (CGE) е CE версия на електрофореза с плочи гел и се използва за разделяне на биологични макромолекули, като олигонуклеотиди, ДНК фрагменти и протеини. В CGE се използват омрежени или не омрежени матрици за пресяване. Омрежените гелове имат дефинирана структура на порите и размер. Неомрежените физически гелове, образувани от линейни полимерни мрежи, имат динамична структура на порите с много по-висока гъвкавост в сравнение с омрежените гелове. Разделянето се извършва чрез запълване на капиляра с пресяваща матрица като омрежен полиакриламид или разтвори на линеен полимер от полиетилен гликол и хидроксиметил целулоза. Основните предимства на CGE пред електрофорезата върху плочи-гел са използването на по-широк спектър от материали с гел-матрица, онлайн откриване, подобрено количествено определяне и автоматизация.

Групата на Novotny съобщава за анализи на линейни полизахариди, чиито редуциращи краища са флуоресцентно маркирани с 8-аминопирен-1,3,6-трисулфонат (APTS), използвайки LPA покрити капиляри и LIF детектиране. Те успяха в изходната резолюция на олигомерите на хиалуроновата киселина до степени на полимеризация от 390 (80 kDa молекулни маси) чрез използване на 5% LPA в 12,5 mM Tris буфер (рН 3,0). 34 Групата на Kakehi съобщава за фина разделителна способност на полимери на (α2-8) свързана N-ацетилневраминова киселина и хиалуронова киселина чрез използване на 0,1 М трис-0,25 М борат (рН 8,5), съдържащ полиетилен гликол 70 000 при концентрация 10%. 35 По време на оптимизирането на условията на разделяне те откриха, че малките олигомери на такива полизахариди се държат като по-големи олигомери и се наблюдават в по-късни времена на миграция и обсъждат връзката между молекулните размери на олигомерите и тяхната биологична активност.

КАДМИЙ

Гел електрофореза с лазерна аблация, приложена към кадмиевата спецификация в протеините

Гел електрофорезата е добре позната техника за разделяне на сложни среди като протеини. Класическите начини на откриване (включително оцветяване с багрило, имунореакция с антисеруми и авторадиография) не позволяват откриването на метално-протеинови комплекси. В контекста на химическата спецификация, нова хифенизирана техника, лазерна аблация, индуктивно свързана плазмена масова спектрометрия (LA – ICP-MS), в комбинация с гел електрофореза, се появява като нововъзникващ и мощен инструмент за изследване на металокомплексация на протеини, даваща многоелементна информация за метали, свързани с предварително отделените металопротеини.

След разделянето на протеина чрез едно- или двумерна електрофореза, геловете се изсушават и се подлагат директно на LA – ICP-MS, за да се открият, картографират и количествено определят разпределението на металите в отделни петна (съединения). Накратко, петно ​​от пробата се аблатира от лазера и аблатираният шлейф се довежда до плазмата чрез непрекъснат газов поток, обикновено аргон. След това ICP-MS дава многоелементния състав на протеина, присъстващ в аблатното място. Този метод вече е докладван за Cd видообразуване в MTs и в други Cd-свързващи протеини от бактериални екстракти. Моделите на метални протеини в гелове, идващи от клетки, отглеждани при условия на Cd-стрес, могат да бъдат сравнени много бързо с ненатоварени култури, за да се изследва индуцирането на МТ от метали.

Електрофоретични подходи за събиране на проби и подготовка за анализ на нуклеинови киселини

Резюме:

Гел електрофорезата е неразделна част от лабораториите по молекулярна биология в продължение на десетилетия, намирайки полезност при анализ, разделяне, молекулярно инженерство и почистване на нуклеинови киселини. Той продължава да бъде усъвършенстван и нововъзникващите технологии позволяват фин контрол на ДНК и РНК в гел. Една от тези технологии, SCODAphoresis, дори осигурява превъзходно отделяне от често срещани инхибитори като хуминови киселини в почвата, позволявайки екстракция и анализ на ДНК от матрици на проби, които не са били екстрахирани преди. Електрофоретичното разделяне на пробите от нуклеинови киселини ще продължи да бъде важна част от работния процес от пробата към отговор, като осигурява по-чисти аналити за анализи надолу по веригата като клинична диагностика, полимеразна верижна реакция (PCR) и секвениране.

Молекулярна биология и генно инженерство

Разделяне на ДНК

Техниките на гел електрофореза разделят молекулите на ДНК по размер. 43-45 Полиакриламиден гел с малък размер на порите се използва за отделяне на едноверижни ДНК фрагменти с дължина по-малка от 500 нуклеотида (с размер от 10 до 500 нуклеотида), които се различават по размер с по-малко от един нуклеотид. Агарозен гел със среден размер на порите се използва за фракциониране на двуверижната ДНК молекула (с размер от 300 до 10 000 нуклеотидни двойки). ДНК лентите в електрофорезата в полиакриламиден гел и агарозен гел са невидими, освен ако ДНК не се оцветява с етидиев бромид или не се маркира с радиоизотоп 32 Р преди извършване на електрофореза. Вариант на електрофорезата в агарозен гел, електрофорезата в агарозния гел с пулсово поле, разделя изключително дългите ДНК молекули. Тази техника е използвана за разделяне на 16 различни хромозоми на Saccharomyces cerevisiae, които варират по размер от 220 000 до 2,5 милиона двойки нуклеотиди.

Методи за разделяне

4.2 Капилярна гел електрофореза

Капилярна гел електрофореза [55, 56] (CGE) е много подобна на CZE. Основната разлика е, че в CGE колоната е пълна с гел, който влияе върху движението на аналитите. Съответно разделянето ще се определя не само от електрофоретичната сила, действаща върху йоните, но и от размера на молекулите на аналита. Ефектът на гела, намиращ се вътре в колоната, има подобен ефект като хроматографията за изключване на размера (вж. По-рано). Типично приложение е разделянето на протеини в капиляр, който е изпълнен с полиакриламиден гел и натриев додецил сулфат (SDS). Наличието на SDS подпомага електрофоретичната подвижност на протеините, тъй като покрива повърхността им пропорционално на техния размер. Следователно, молекулярната структура ще има малко влияние върху подвижността, така че макромолекулите ще мигрират в зависимост от тяхната молекулна маса. Тази техника е много подобна на SDS-PAGE.

Клетъчни наранявания, клетъчни отговори на наранявания и клетъчна смърт

Клетъчна некроза

Некрозата е форма на клетъчна смърт, която обикновено води до унищожаване на много съседни паренхимни клетки и може да обхване цяла тъкан или орган. Исхемичната некроза в резултат на съдова оклузия е най-честата форма на некроза, срещана клинично. Исхемичната некроза обикновено произвежда морфологичния модел на коагулационната (коагулативна) некроза. При коагулативната некроза клетките не претърпяват енергийно зависим, организиран процес, който води до фрагментация на клетките. По-скоро енергийното изчерпване води до разграждане на йонни градиенти през клетъчните мембрани, което първоначално причинява приток на натрий и вода (подуване на клетките) и в крайна сметка води до навлизане на калций в клетъчната цитоплазма от външната среда и от митохондриите (при които окислителното фосфорилиране е спрял поради хипоксия). Тези промени могат бързо да доведат до необратимо увреждане на клетките с високи метаболитни изисквания, докато други видове клетки са по-устойчиви на исхемично увреждане. По-големите метаболитни изисквания към тъканите (висока скорост на репликация, съществена съкратителна функция) са склонни да ускоряват увреждането на клетките и да насърчават некрозата.

В някои некротични клетки ядрото може да се свие (пикноза), преди да изчезне (кариолиза). При някои форми на некроза кариолизата протича без пикноза. Некрозата винаги е свързана с изразено остро възпаление (за разлика от апоптозата) и предизвиква предимно неутрофилен инфилтрат. Деградиращите ензими от възпалителни клетки усвояват некротичната тъкан и подготвят мястото за заздравяване или възстановяване (фиг. 1-22). Наличието на излишни възпалителни клетъчни ензими също може да доведе до допълнително или преувеличено разрушаване на тъканите, по-голямо от първоначалната обида.

Гел Електрофореза

Гел електрофорезата е аналитична техника, която позволява разделяне на размера на ДНК, както и на други макромолекули.

За гел електрофореза ДНК проба се зарежда в единия край на гел матрица (обикновено агароза или акриламид), която осигурява еднакъв размер на порите, през които ДНК молекулите могат да се движат. Прилагането на постоянно електрическо поле кара ДНК фрагментите (всички да имат еднороден, силен отрицателен заряд) да мигрират към катода. Докато се движат през гела, по-дългите фрагменти се забавят повече от по-късите фрагменти и тяхната миграция е пропорционална на логаритъма на дължината на ДНК фрагмента. Тази връзка се поддържа в редица размери на ДНК и може да се постигне полезно разделяне на ДНК фрагменти от няколко нуклеотида с дължина до 25 000 нуклеотида, като се използва набор от гелове с различна концентрация.

Стандартите за молекулно тегло осигуряват средство за калибриране на гела и оценка на молекулното тегло.

По-големите молекули на ДНК могат да бъдат разделени с помощта на електрофореза с импулсно поле, която използва различни принципи на разделяне.