Молекулярен вроден имунитет

Тази статия е част от изследователската тема

NETosis 2: вълнението продължава Вижте всички 39 статии

Редактиран от
Мариана Дж. Каплан

Национален институт по артрит и мускулно-скелетни и кожни болести (NIAMS), САЩ

Прегледан от
Михаела Гаджева

Медицинско училище в Харвард, САЩ

Жан-Марк Кавайон

Институт Пастьор, Франция

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

ефект

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет, Национален университет в Сингапур, Национална университетска здравна система, Сингапур
  • 2 Катедра по патология, Национална университетска болница, Национален университет в Сингапур, Национална университетска здравна система, Сингапур
  • 3 Център за ветеринарни здравни науки, Държавен университет в Оклахома, Stillwater, ОК, САЩ

Затлъстяването е независим рисков фактор за тежък изход от грипна инфекция. По-високата консумация на мазнини в храната е свързана с по-голяма заболеваемост и тежък грип при модели на мишки. Досега обаче степента на генериране на неутрофилни извънклетъчни капани (NETs или NETosis) при затлъстели индивиди по време на грипна пневмония досега не е известна. Това проучване изследва генерирането на белодробни NETs при мишки BALB/c, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), по време на грипната пневмония. Клиничната прогресия на заболяването, хистопатологията, белодробните реактивни кислородни видове и активността на миелопероксидазата също са сравнени. Консумацията на HFD в продължение на 18 седмици води до значително по-високо телесно тегло, индекс на телесна маса и затлъстяване при мишки BALB/c в сравнение с LFD. Смъртоносното предизвикване на мишки (на HFD и LFD) с грипен A/PR/8/34 (H1N1) вирус доведе до подобна загуба на телесно тегло и хистопатологична тежест. Въпреки това, NETs се образуват при относително по-високи нива при мишки, хранени с HFD, въпреки липсата на значителна разлика в прогресията на заболяването между мишки, хранени с HFD и LFD.

Въведение

Неутрофилите освобождават неутрофилни извънклетъчни капани (NET), за да заловят и убият патогени, като бактерии и гъбички (1, 2), но ограничени проучвания разглеждат тяхната роля при вирусни инфекции (3-5). NETs могат да заловят и неутрализират HIV-1 по TLR7- и TLR8-зависим начин (4). От друга страна, когато мрежите присъстват в голям брой, те могат да причинят увреждане на тъканите чрез освобождаване на цитотоксични протеини в извънклетъчното пространство. По-рано разкрихме бурна инфилтрация на активирани неутрофили и широко генериране на белодробни NETs при смъртоносно предизвикване на мишки с грипен вирус, които допринасят за нараняване на белите дробове (6). Също така демонстрирахме връзката между белодробната NETosis и хистопатологичната тежест при мишки по време на летална пневмококова суперинфекция след грипна белодробна инфекция (7, 8). Тези проучвания подчертават патологичната роля на белодробните NET по време на грипна пневмония.

Затлъстяването е свързано с хронично нискостепенно възпаление (9). Излишъкът на хранителни вещества ограничава кръвоснабдяването на адипоцитите, което води до хипоксия, която може да предизвика некроза и макрофагична инфилтрация на мастната тъкан, което от своя страна води до свръхсекреция на провъзпалителни цитокини (10, 11). Самите адипоцити секретират адипокини, като TNF-α и IL-6, които са провъзпалителни и свързани с различни метаболитни състояния (12, 13). Увеличена периферна неутрофилна активност, като генериране на супероксид, се наблюдава при здрави затлъстели индивиди и може да се отдаде на цитокини, като IL-8, секретиран от адипоцитите (14, 15). Въпреки че провъзпалителните цитокини, като TNF-α и IL-8, могат да индуцират NETosis (1, 16), ефектите на затлъстяването и свързаното с тях възпаление върху NETosis все още са неясни.

Затлъстяването е документирано като независим рисков фактор за усложнения, произтичащи от тежък грип по време на пандемията H1N1 през 2009 г. (17, 18). По-ранните модели на мишки с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) също свързват степента на затлъстяване с тежък грипен изход и произтичащата от това белодробна патология и имунна дисфункция (19–21). Досега не е известна връзката между белодробната NETosis и резултата от грипната пневмония при затлъстели лица. Като се има предвид, че мастните тъкани благоприятстват провъзпалителна среда, която потенциално може да активира неутрофили, ние предполагаме, че по-високата адипозия може да допринесе за по-голямо образуване на белодробни NET, което влошава патологичния резултат от грипната пневмония. Целта на това проучване беше да се изследват и сравнят ефектите от диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) спрямо диетата с ниско съдържание на мазнини (LFD) върху степента на NETosis в белите дробове на мишки BALB/c по време на летално инфлуенчно предизвикателство.

Материали и методи

Животни, етика и режим на хранене

Всички експерименти с животни са извършени съгласно разпоредбите на Институционалния комитет за грижи и употреба на животните, Национален университет в Сингапур (номер на протокол 050/11). Четириседмични мъжки мишки BALB/c бяха аклиматизирани за 1 седмица със стандартна чау преди да започнат планирана диета (Research Diets). Мишките бяха разделени на случаен принцип в две групи, т.е. всяка група беше хранена с LFD (10% kcal от хранителни мазнини) или HFD (45% kcal от хранителни мазнини) в продължение на 18 седмици. Всяка седмица се осигуряваха пресни фуражи. Телесното тегло, ИТМ [тегло (g)/дължина от носа до ануса (mm 2)] и приема на храна се измерват ежеседмично. Консумираните калории се изчисляват въз основа на консумираната храна (т.е. 1 g LFD = 3.85 kcal; 1 g HFD = 4.73 kcal). Нивата на кръвната глюкоза са измервани с помощта на глюкометър Accu-Check Performa (Roche) в началото и в края на 18-седмичния хранителен режим. В края на 18-те седмици бяха взети органи като бели дробове, мозък, бъбреци, сърце, черен дроб, далак, бяла мастна тъкан (WAT) на половите жлези, периреналните области и междулопаточната кафява мастна тъкан (IBAT) от двете групи мишки, претеглени и разделени за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E).

Инфекция на мишки с грипен вирус

Грипният вирус A/Пуерто Рико/8/34 (H1N1) щам (PR8) от Американската колекция от типови култури се размножава в ембрионирани яйца, както е описано по-горе (7). След 18-седмичния хранителен режим, мишките от двете диетични групи бяха интратрахеално предизвикани с летална доза PR8 вирус, т.е. 50 единици, образуващи плаки (PFU). Анестезията се извършва, като се използват 75 mg/kg кетамин и 1 mg/kg медетомидин, и се обръща, като се използва атипамезол хидрохлорид (5 mg/ml). Контролните мишки получават само буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS). Мишките бяха евтаназирани на 6 и 10 дни след инфекцията (DPI), белите им дробове бяха изрязани, като единият лоб беше фиксиран в 4% параформалдехид, докато другият лоб беше бързо замразен за следващи анализи.

Хистопатологично точкуване на белодробна тъкан

Фиксираните с формалин бели дробове бяха дехидратирани и вградени в парафин. Белодробните участъци (5 μm), оцветени с H&E, бяха подложени на хистопатологично точкуване по заслепен начин въз основа на модифицирани критерии (22). Крайният резултат за нараняване се изчислява по формулата: 1 × (алвеоларен кръвоизлив, 0–3) + 2 × (алвеоларен инфилтрат, 0–3) + 2 × (бронхиоларен инфилтрат, 0–3) + 2 × (фибрин, 0 –3) + 1 × (задръстване на алвеоларната преграда, 0–3), където 0–3 се отнасят до 0 = отсъства, 1 = леко, 2 = умерено и 3 = тежко.

NETs Оцветяване и количествено определяне в белодробната тъкан

Неутрофилните извънклетъчни капани в белодробните секции се определят количествено чрез тройно имуномаркиране, както е описано по-горе (7). Накратко белодробните секции (5 μm) бяха оцветени с антитела срещу хистон H2B (Abcam) и миелопероксидаза (MPO, Abcam) и DAPI (Life Technologies). NETs бяха идентифицирани като единични нишки или клъстери и бяха оценени съгласно предварително определени критерии (0–10). Бяха анализирани двадесет полета и сумата беше изчислена за крайния резултат от NETs.

Определяне на вирусни титри

Замразените белодробни тъкани се хомогенизират с помощта на нежния диспергатор на тъкани MACS (Miltenyi Biotech). Вирусните титри се определят чрез анализ на плаката, както е описано по-рано (23).

Анализи на водороден пероксид и миелопероксидаза

Концентрациите на водороден пероксид (H2O2) в белите дробове се измерват с помощта на комплекта за анализ на червения водороден пероксид/пероксидаза на Amplex (Invitrogen). MPO активността беше определена, както е описано по-горе (8). Накратко, 10 μl белодробен хомогенат се смесва с 190 μl прясно приготвен разтвор за анализ (26,9 ml H2O, 2,0 ml 0,1 M натриев фосфатен буфер рН 7,0, 0,1 ml 0,1 M H2O2 и 0,048 ml гваякол) и абсорбцията се отчита веднага при 470 nm за 1 min. MPO активността се изчислява като единици/ml = (ΔO.D. × Vt × 4)/(Е. × Δt × Vs) × 2, където ΔO.D. = промяна на оптичната плътност, Vt = общ обем (милилитра), Е. = 26,6 mM -1 cm -1 (коефициент на екстинкция на тетрагуаяколов продукт), Δt = време на измерване (минути), Vs = обем на пробата (милилитра), а 2 е коефициентът на преобразуване в 1 cm дължина на пътя. Всички стойности бяха нормализирани до съдържанието на белодробен протеин, измерено по метода на Брадфорд (Bio-Rad).

Статистически анализи

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SPSS (версия 22). Студентски т-тестът е използван за анализ на параметрични данни, докато Mann-Whitney U тестът е използван за непараметричен анализ на данни. ANOVA с Tukey post hoc корекцията е използвана за сравнение на повече от две групи. P-стойности под 0,05, 0,01 и 0,001 се считат за значими в различна степен.

Резултати

HFD мишките качват по-високо телесно тегло и телесни мазнини в сравнение с LFD мишки

Мишките с HFD показаха значително по-високо телесно тегло (P Ключови думи: неутрофили, NET, диета с високо съдържание на мазнини, грип, пневмония

Цитиране: Moorthy AN, Tan KB, Wang S, Narasaraju T и Chow VT (2016) Ефект от диета с високо съдържание на мазнини върху образуването на белодробни неутрофилни извънклетъчни капани по време на грипна пневмония при мишки BALB/c. Отпред. Имунол. 7: 289. doi: 10.3389/fimmu.2016.00289

Получено: 26 април 2016 г .; Приет: 19 юли 2016 г .;
Публикувано: 02 август 2016 г.

Мариана Джулиета Каплан, Национален институт по артрит и мускулно-скелетни и кожни заболявания, САЩ

Михаела Гаджева, Харвардско медицинско училище, САЩ
Жан-Марк Кавайон, Институт Пастьор, Франция