Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Кореспонденция

J. Bernd Helms, Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Yalelaan 2, 3584 CM Утрехт, Холандия.

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по клинични науки за домашни животни, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Утрехт, Холандия

Кореспонденция

J. Bernd Helms, Катедра по биохимия и клетъчна биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Yalelaan 2, 3584 CM Утрехт, Холандия.

Информация за финансиране: Фондация Уин Фелин, грант/номер на награда: W17‐015

Резюме

Заден план

Чернодробната липидоза нараства в Западния свят, като котките са особено чувствителни. Когато котките спрат да ядат и започнат да използват запасите си от мазнини, свободните мастни киселини (FFA) се увеличават в кръвта, причинявайки натрупване на триацилглицерол (TAG) в черния дроб.

Обективен

Идентифициране на потенциални нови лекарства, които могат да се използват за лечение на чернодробна липидоза при котки, използвайки котешка чернодробна органоидна система.

Животни

Чернодробни органоиди, получени от 6 котки.

Методи

Тествани бяха осем различни лекарства, а 2-те най-обещаващи бяха допълнително проучени с помощта на количествен анализ на TAG, оцветяване на липидни капчици и qPCR.

Резултати

Както T863 (инхибитор на диацилглицерол О-ацилтрансфераза 1 [DGAT1]), така и 5-аминоимидазол-4-карбоксамид 1-β-D-рибофуранозид (AICAR; активатор на аденозин монофосфат киназа) намаляват натрупването на TAG с 55% (P

Заключения и клинично значение

Идентифицирани са две потенциални лекарства, полезни при лечението на чернодробна липидоза при котки. Лекарството T863 инхибира DGAT1, което показва, че DGAT1 е основният ензим, отговорен за синтеза на TAG от външни мастни киселини в органоидите на котките. Лекарството AICAR може да действа като понижаващо липидите съединение чрез намаляване PLIN2 иРНК. Чернодробните органоиди могат да се използват като in vitro инструмент за тестване на лекарства в специфична за даден вид система и да предоставят основата за по-нататъшно клинично тестване на лекарства за лечение на стеатоза.

Съкращения

1. ВЪВЕДЕНИЕ

2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1 Клетъчна култура

2.2 Наркотици

Лекарствата (вж. Таблица S1 за мишени и референции) бяха разтворени в диметилсулфоксид и използвани в концентрации, както е описано в литературата. Първоначалният скрининг се състои от култивиране на недиференцирани котешки чернодробни органоиди от 3 донори в присъствието или отсъствието на лекарствата, както е посочено в таблица S1, и в присъствието на допълнителни мастни киселини за стимулиране на натрупването на липиди. TAG анализът се използва за определяне на TAG количества. Лекарствата, които инхибираха натрупването на TAG в органоиди от 3 котки, бяха избрани за допълнителни тестове. Избрани лекарства и концентрации, използвани след първоначалния скрининг, са 5-аминоимидазол-4-карбоксамид 1 β-D-рибофуранозид (AICAR; Sigma) при концентрация 2 mM, T863 (Sigma) при концентрация 20 μM и PF 06424439 ( Sigma) при концентрация 50 μM. Органоидите се култивират в продължение на 24 часа в присъствието на допълнителни мастни киселини и лекарства (или контрол на носителя) преди вземане на проби.

2.3 Анализ на триацилглицерол

Пробите бяха обработени с ултразвук и 10% от пробата бяха използвани за измерване на концентрацията на протеин за целите на нормализирането, като се използва комплект за анализ на протеин на бирхонцинова киселина на Pierce (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts). Другата част е използвана за извличане на липиди по предварително описан метод. 10 Пробите се измиват с метанол, за да се предотврати замърсяване с хлороформ и се сушат под азотен газ. Количественото определяне на TAG се извършва, като се използва монокит TriglyceridesLiquiColor (HUMAN, Wiesbaden, Германия) с триолеин като стандарт. След инкубация с реактива за анализ на триглицеридите Liquicolor в продължение на 90 минути във разклащаща се водна баня, TAG се измерва с помощта на спектрофотометър с четец на микроплаки при изчезване от 540 nm (Molecular Devices, VersaMax, Sunnyvale, California).

2.4 Изолация на РНК и количествена PCR

Проба от РНК се изолира с помощта на RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Германия), включително обработка с колона DNase-I, за да се сведе до минимум замърсяването с gDNA. Впоследствие cDNA се синтезира с помощта на iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Херкулес, Калифорния). PCR амплификациите бяха извършени с помощта на система за откриване Bio-Rad с iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Кривата на стопяване и анализът на последователността потвърждават специфичността на ампликона и относителните нива на експресия се нормализират, като се използват референтните гени тирозин 3-монооксигеназа/триптофан 5-монооксигеназа активационен протеин, зета (YWHAZ), рибозомен протеин S5 (RPS5), хипоксантин фосфорибозилтрансфераза (HPRT ‐ 1) и хидроксиметилбилан синтаза (HMBS). Праймери, използвани за PCR амплификация на гени от интерес и праймери за референтните гени са показани в Таблица S2.

2.5 Флуоресцентно изобразяване на цели монтажни органоиди

Органоидите бяха внимателно отстранени от Matrigel и фиксирани с 10% неутрален буфериран формалин. Ядрата бяха оцветени с 30 μg/mL Hoechst 33342 (Molecular Probes, Paisley, UK), а липидните капчици бяха оцветени с 0.1 μg/mL LD540 (липофилно багрило, любезно предоставено от Christoph Thiele). Фиксираните органоиди се инкубират с багрилата за 15 минути във фосфатно буфериран физиологичен разтвор и след измиване органоидите се монтират във FluorSave (Calbiochem, Billerica, Massachusetts). Снимките са направени с конфокален микроскоп Leica TCSSPE-II в Центъра за клетъчно изобразяване (Факултет по ветеринарна медицина, Университет Утрехт, Холандия).

2.6 Статистика

За статистически анализи беше извършен двупосочен дисперсионен анализ, използващ тест за множество сравнения на Dunnett, като лечението и котката бяха 2 нива.

3 РЕЗУЛТАТА

Добавянето на палмитат и олеат към котешки органоиди води до натрупване на TAG и липидни капчици, както се наблюдава при флуоресцентна микроскопия и анализ на флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). 8 Количественото определяне на натрупването на TAG показа 4-кратно (± 1,3, P 8 и фигура S1).

лечение

Тъй като диференцираните органоиди могат дори по-точно да имитират in vivo черен дроб, органоидите от 3 различни донора бяха диференцирани спрямо хепатоцитната линия. Диференциацията беше потвърдена с помощта на qPCR (Фигура 3А). Експресията на маркера на стволови клетки, богат на левцин, повтарящ се, съдържащ G протеин-свързан рецептор 5 намалява и експресията на чернодробни маркери транстиретин и CYP3a132 увеличен. Основните концентрации на TAG (без добавяне на FFA и лекарства) се увеличават в органоидите след диференциация в сравнение с органоидите преди диференциацията (Фигура 3В). Когато диференцираните органоиди бяха третирани с AICAR и T863, резултатите бяха подобни на тези на недиференцираните органоиди. Лечението с AICAR намалява натрупването на TAG с 45% (P = .006), а лечението с T863 намалява натрупването на TAG с 52% (P = .002; Фигура 3С).

Механизмът, чрез който T863 намалява натрупването на TAG, най-вероятно е чрез инхибиране на целта му, синтезиращия TAG ензим DGAT1. По-малко очевиден е механизмът, чрез който активаторът на AMP киназа AICAR намалява TAG. Перилипин 2 (PLIN2, известен също като свързан с мастната диференциация протеин) е протеин, присъстващ върху липидните капчици и е известно, че стабилизира липидните капчици. Експресията на ген на PLIN2 се увеличава с добавянето на мастни киселини към средата. 8 Затова измерихме PLIN2 концентрации на иРНК при използване на qPCR и установи, че лечението с AICAR значително намалява експресията на PLIN2 в натоварени с липиди органоиди (Фигура 4). При тези условия, PLIN2 експресията не се различава статистически от инкубацията при липса на допълнителни мастни киселини. Този ефект е специфичен за AICAR, тъй като другото понижаващо TAG лекарство T863 не повлиява значително PLIN2 концентрации на иРНК. Както диференцираните, така и недиференцираните органоиди се държаха по подобен начин (P = .57; Фигура 4).

4. ДИСКУСИЯ

Чернодробната органоидна система на котките беше успешно използвана за идентифициране на лекарства, потенциално полезни при лечение на котки, развиващи чернодробна липидоза. Както T863 (инхибитор на DGAT1), така и AICAR (активатор на AMP киназа) намаляват натрупването на TAG, както преди, така и след диференциацията на възрастните чернодробни стволови клетки към хепатоцитната линия. Фактът, че недиференцираните чернодробни органоиди дават подобни резултати, както диференцираните органоиди, засилва използването на недиференцирани чернодробни органоиди за бъдещ скрининг на лекарства и по-механистични проучвания, като по този начин намалява количеството време и ресурси за тези експерименти, както и заключението ни, че тези агенти са обещаващи кандидат-лекарства за клинично приложение.

Известно е, че два ензима катализират последния етап от образуването на TAG от диацилглицерол (DAG) и мастен ацил-КоА: DGAT 1 и 2. Диацилглицерол О-ацилтрансфераза 1 нокаут мишки са жизнеспособни, за разлика от нокаут мишки DGAT2 . Освен това, мишките с дефицит на DGAT1 са устойчиви на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, и имат повишена чувствителност към инсулин. 11, 12 Те са защитени от чернодробна липидоза, предизвикана от екзогенни мастни киселини, или от диета с високо съдържание на мазнини, или от гладуване. Както специфичният за черния дроб, така и общият нокаут доведоха до защитата срещу чернодробна липидоза. 13 Разработени са няколко инхибитора на DGAT1, T863 е един от тях. Прилагането на инхибитори на DGAT1 на мишки води до намаляване на серумните и чернодробните TAG, причинява загуба на тегло при затлъстели мишки и повишена чувствителност към инсулин. 14, 15 Докато мишките понасят много добре лечение с инхибитори DGAT1, клиничните изпитвания при хора са свързани с неблагоприятни стомашно-чревни ефекти, главно тежка диария. 15 Тази видова разлика може да се дължи на факта, че хората нямат експресия на DGAT2 в тънките черва. 16 Дали DGAT2 се експресира в котешките черва е неизвестно.

В нашия котешки модел, DGAT1 инхибитор намалява натрупването на TAG, докато DGAT2 инхибитор не. Това наблюдение предполага, че DGAT1 е главно важен при синтеза на TAG от външни мастни киселини. Това заключение е в съгласие с описана по-рано моделна система 13, показваща ролята на DGAT1 в отговора на екзогенни мастни киселини. Прилагането на комбинация от инхибитори DGAT1 и DGAT2 води до по-силно инхибиране на натрупването на TAG, отколкото само инхибиторът DGAT1. Потенциално, DGAT2 може да участва в синтеза на TAG в нашата система, в която DGAT1 може да компенсира инхибирането на DGAT2, но не и обратно. Възможно е също така, че DGAT2 става активен само ако няма налична дейност на DGAT1.

Както при всички лекарства, които пречат на синтеза и натрупването на TAG, липотоксичността, причинена от FFA, може да е причина за повишено внимание при лечението на котки с чернодробна липидоза, използващи DGAT1 инхибитори. Тъй като при котки с чернодробна липидоза концентрацията на FFA и потокът в кръвта са високи, предотвратяването на образуването на TAG може да причини преместване на мастни киселини в други тъкани или да увеличи разграждането на мастните киселини. Само когато няма достатъчен капацитет за окисляване на мастни киселини, натрупването на FFAs може да причини цитотоксичност. Освен това, DGAT1 е замесен в защитата на митохондриалната функция чрез предотвратяване на липотоксичност по време на автофагия, предизвикана от глад. 17 По същия начин е съобщено, че DGAT1 защитава ендоплазмения ретикулум на адипоцитите от липотоксичност по време на липолиза чрез препакетиране на част от освободените FFA обратно в TAG. 18.

Въпреки че мишките понасят добре инхибирането на DGAT1, неблагоприятните стомашно-чревни ефекти, наблюдавани при хората, и потенциалът на повишена липотоксичност предполагат повишено внимание при използването им за лечение на котки с чернодробна липидоза. Доколкото ни е известно, DGAT1 инхибиторите не са били използвани при котки преди и потенциалните неблагоприятни in vivo ефекти при този вид са неизвестни.

Нашите резултати показват намаляване на експресията на PLIN2 след лечение с AICAR. Перилипин 2 е протеин, присъстващ върху липидни капчици, за който е известно, че влияе върху съхранението на липидите в липидните капчици. Нокдаунът на PLIN2 при мишки намалява размера и броя на липидните капчици и намалява общото количество TAG в черния дроб на мишките. Нокдаунът предпазва от чернодробна липидоза, предизвикана от хранене на мишки с високо съдържание на мазнини. 26, 27 Предполага се наличието на PLIN2 върху липидни капчици за защита на липидните капчици от разграждане чрез автофагия. 26 PLIN2 протеинът може да бъде фосфорилиран от AMPK, след което е насочен към разграждане в лизозомите чрез аутофагия, медиирана от шаперон. 28 След отстраняване на PLIN2, липидните капчици стават податливи на разграждане или от цитозолни липази, или от макроавтофагия. 29 Нашите резултати показват, че иРНК експресията на PLIN2 се увеличава при добавяне на мастни киселини към средата и това увеличение се предотвратява чрез лечение с AICAR, но не значително след лечение с T863. Остава да се определи дали AICAR действа пряко или косвено PLIN2 израз.

В заключение бяха идентифицирани 2 потенциални лекарства, полезни при лечението на котки с чернодробна липидоза. Лекарството T863 инхибира DGAT1, което показва, че DGAT1 е основният ензим, отговорен за синтеза на TAG от външни мастни киселини в органоидите на котешкия черен дроб. Лекарството AICAR може да действа като понижаващо липидите съединение чрез намаляване PLIN2 експресия на иРНК. Нашето проучване показва възможността за използване на котешки възрастни стволови клетки като in vitro инструмент за тестване на лекарства в специфична за даден вид система и предоставя основата за по-нататъшно клинично тестване на тези лекарства за понижаване на стеатозата.

ПРИЗНАВАНИЯ

Това проучване беше спонсорирано от фондация Winn Feline (грант № W17-015). Благодарим на Ингрид Верноой за изпълнението на пилотни експерименти за проекта.