Ялда Хосрави

1 Катедра по медицинска микробиология, Медицински факултет, Университет в Малая, Куала Лумпур, Малайзия

Shih Wee Seow

2 Национален център за борба с рака, Сингапур, Сингапур

Арлейн Ан Амойо

2 Национален център за борба с рака, Сингапур, Сингапур

Kher Hsin Chiow

3 Училище за химически науки и науки за живота, Сингапурска политехника, Сингапур

Туан Лин Тан

3 Училище за химически науки и науки за живота, Сингапурска политехника, Сингапур

Уай Йен Уонг

3 Училище за химически и биологични науки, Сингапурска политехника, Сингапур

Qian Hui Poh

3 Училище за химически и биологични науки, Сингапурска политехника, Сингапур

Игнатий Марио Доли Сентоса

3 Училище за химически и биологични науки, Сингапурска политехника, Сингапур

Ралф М. Бунте

4 Висше медицинско училище Duke-NUS, Сингапур

Свен Петтерсон

5 Катедра по микробиология, туморна и клетъчна биология (MTC), Karolinska Institutet, Стокхолм, Швеция

6 LKC School of Medicine, Nanyang Technological University, Сингапур, Сингапур

7 SCELSE Microbiome Center, Nanyang Technological University, Сингапур, Сингапур

Мун Фай Локе

1 Катедра по медицинска микробиология, Медицински факултет, Университет в Малая, Куала Лумпур, Малайзия

Джамуна Вадивелу

1 Катедра по медицинска микробиология, Медицински факултет, Университет в Малая, Куала Лумпур, Малайзия

Резюме

Древният стомашен патоген, Helicobacter pylori, е ключов член на човешкия стомашен микробиом. Той еволюира съвместно с човешката раса и нашата връзка с H. pylori може да бъде проследена още преди 60 000 години 9. Освен това, той се намира в стомаха на повече от половината от световното население, независимо от етническата принадлежност и географския регион 10. Много от тях са придобили бактериите през ранното детство чрез вътрешно-фамилно предаване и колонизацията е доживотна, освен ако не бъде унищожена чрез медицинска намеса 9. Въпреки че повечето носители остават безсимптомни, около 20% от тях в крайна сметка развиват стомашно-дуоденални заболявания (като хроничен гастрит, пептична язва и стомашен аденокарцином) в по-късните етапи от живота 11. Много фактори, включително H. pylori, чревната микробиота, гостоприемника и околната среда, могат да допринесат за развитието на свързани с H. pylori заболявания.

В това проучване имахме за цел да изследваме взаимодействието между H. pylori и нормалната чревна микробиота през ранните етапи от живота, използвайки модели на мишки GF и SPF. За да разберем влиянието на H. pylori и нормалната чревна микробиота върху развитието на метаболитната и имунната система, ние оценихме промените в чревните метаболитни хормони и цитокини/хемокини в отговор на колонизацията на H. pylori както при GFH, така и при SPFH мишки.

Резултати и дискусия

Възстановихме H. pylori от инокулирани SPFH и GFH мишки на 2-, 8- и 16-седмична постколонизация. Това показа, че щам 298 на H. pylori успешно колонизира стомаха на мишките, инокулирани с този организъм. От друга страна, нито една от SPF и GF мишките не е била положителна за H. pylori.

В това проучване измерихме теглото на контролните SPF, колонизираните с H. pylori SPFH, контролните GF и колонизираните с H. pylori GFH мишки на 2-, 8- и 16-седмична постколонизация (Фигура 1). В края на 16 седмици нито SPF, нито SPFH мишките са страдали от значителна загуба на тегло (p> 0,05). Обаче, GFH мишките страдат от значително забавено увеличаване на теглото в сравнение с GF мишки (стр. 12, 13. По-ранни проучвания показват, че мишки без микроби се нуждаят от 30% повече калории в сравнение с конвенционалните мишки, за да запазят подобна телесна маса 12. По същия начин друго проучване демонстрира, че мишки без микроби ядат повече, но имат значително по-малко телесни мазнини от конвенционалните мишки 13. В същото проучване мишки без микроби, които са били инокулирани с микробиота, събрана от дисталното черво (цекума) на конвенционално отгледани мишки, са спечелили 60% Всъщност нормалната чревна микробиота играе важна роля за определяне на енергийната реколта от диетата и съхранението на енергия в нейния приемник. Ролята на H. pylori и нейното взаимодействие с нормалната чревна микробиота не са проучени.

хеликобактер

(A) GF и GFH мишки са имали значително по-високо ниво на грелин до 16 седмици след експеримента, отколкото SPF и SPFH мишки (p Фигура 2В). За разлика от тях, H. pylori не причинява по-висока секреция на лептин при мишки GFH в сравнение с мишки GF при липса на нормална чревна микробиота. По този начин, H. pylori и нормалната чревна микробиота доведоха до регулиране на лептина, но не и на производството на грелин при SPFH мишки.

Нормалната чревна микробиота и H. pylori индуцират производството на инсулин

Въздействието на H. pylori върху състава и функцията на нормалния чревен микробиом не е напълно изяснено. Независимо от това, в това проучване, нашите предварителни резултати демонстрират, че H. pylori може да промени енергийната хомеостаза на своя гостоприемник и че нормалният чревен микробиом може да има значение за ефекта на H. pylori върху неговия гостоприемник.

Чревни метаболитни хормони и телесна маса

Мета-анализ, докладващ за разпространението на H. pylori и степента на затлъстяване в случайни популационни проби от повече от 100 човешки субекта, открива, че е налице обратна връзка между разпространението на бактериите и честотата на наднорменото тегло/затлъстяването в развитите страни 29. По-рано беше показано, че нивата на циркулиращ с храна лептин и грелин се променят след ликвидиране на H. pylori при човешки доброволци със свързано с това увеличение на телесната маса (BMI), предоставяйки доказателства, че колонизацията на H. pylori може да регулира нивата на грелин и лептин, което засяга тялото морфометрия 30. В това проучване е доказано, че колонизацията на H. pylori при млади GF мишки води до намалено увеличаване на телесната маса.

SPFH мишките са имали значително по-висок лептин, инсулин и PYY на гладно от SPF мишките. Въпреки разликите в хормоналните нива, SPFH мишките имаха нормална телесна маса. Ние постулираме, че свързаната с H. pylori регулиране на PYY стимулира гостоприемника да произвежда повече инсулин и лептин в отговор, като по този начин поддържа нормална телесна маса. Остават обаче да се определят дългосрочните последици от PYY, инсулин и лептин на гладно. От друга страна, мишките GF и GFH имат по-висок грелин, по-нисък лептин и по-нисък инсулин от мишките SPF и SPFH. В допълнение, 16-седмичните GFH мишки са имали по-високо ниво на PYY от GF мишките. Всички тези хормонални разлики между мишките GF и GFH в сравнение с мишките SPF и SPFH могат да бъдат свързани с техните телесни маси. Интересното е, че ефектът на H. pylori върху телесната маса е най-очевиден при GFH мишки при липса на нормална чревна микробиота.

*. Корелацията е значителна на ниво 0,05 (двустранна).

**. Корелацията е значителна на ниво 0,01 (2 опашки).

В нашето проучване инфекцията с H. pylori при мишки с GFH е свързана с високо ниво на PYY в плазмата. Това може да означава голям енергиен разход и висока скорост на метаболизъм при тези мишки, което води до бърза загуба на телесна маса. Въпреки това, наличието на нормална чревна микробиота при SPFH мишки може да осигури буфериране срещу прякото неблагоприятно въздействие на H. pylori върху телесната маса. От друга страна, високото ниво на лептин при SPFH мишки може да потисне приема на храна и по този начин да предотврати затлъстяването на мишките в дългосрочен план. Резултатите върху SPFH мишки от това проучване са в съответствие с наблюдението при хора, че ерадикацията на H. pylori е довела до повишен ИТМ 30. По този начин, H. pylori, регулиращ метаболитните хормони, може да играе роля в задържането на затлъстяването.

Възможни въздействия на чревната микробиота и H. pylori върху ранното развитие

Heijtz et al. съобщава, че същите GF мишки, използвани в това проучване, демонстрират повишена двигателна активност и намалена тревожност в сравнение с SPF мишки 8. Това корелира с променена експресия на гени, регулиращи моторния контрол и поведението, подобно на тревожността. Същият доклад също демонстрира, че GF мишките, изложени на нормална чревна микробиота в началото на живота, имат сходни характеристики с тези на SPF мишки. Това наблюдение може да е свързано с нарушена хранителна абсорбция при GF мишки при липса на нормална чревна микробиота, което е довело до недохранване и загуба на тегло. Добре известно е, че хранителното ниво оказва пряко влияние върху ранните етапи на развитие (включително развитието на мозъка и наставника). Освен това е доказано, че нокаут-мишките с грелин са повишили тревожността в отговор на различни стресови фактори, като остър стрес и социален стрес, в експериментални условия 31. По-високото ниво на грелин при GF мишки може също да обясни промененото поведение при GF мишки, съобщено от Heijtz et al.

Повишеното ниво на еотаксин-1 в кръвната плазма също е свързано със стареенето при мишки и хора 32. Доказано е, че излагането на млади мишки на еотаксин-1 или кръвната плазма на по-възрастни мишки намалява тяхната неврогенеза и когнитивната ефективност при поведенчески задачи, които зависят от неврогенезата в хипокампуса 32. Интересното е, че голямо популационно кохортно ретроспективно проучване в Дания установява корелация между хроничния H. pylori и/или гастрит и болестта на Паркинсон 33. Установено е, че нивото на хемокин, еотаксин-1, е най-високо при SPFH мишки (p Фигура 2G). Еотаксин-1 е един от хемокините, който медиира миграцията на еозинофили, виден компонент на гастрит, предизвикан от H. pylori 34. По този начин, високото ниво на еотаксин-1 при SPFH мишки ни доведе до хипотезата, че тези хемокини служат като ранен индикатор за възпаление и взаимодействието между H. pylori и нормалната чревна микробиота може да засили хроничното възпаление. Следователно е възможно излагането на H. pylori по време на ранните етапи на развитие да има дългосрочни последици за развитието на мозъка. За съжаление не проведохме никакво поведенческо проучване или тестове за двигателен контрол в това проучване за потвърждение.

В заключение, това проучване при SPF и GF мишки със и без H. pylori предполага, че стомашният патоген, H. pylori, взаимодейства с нормалната чревна микробиота, което променя метаболитните и възпалителни пътища на SPFH мишки в сравнение с SPF мишки (Фигура 3). Нашите резултати също така предполагат, че има непрекъснати кръстосани препратки между H. pylori и нормалната чревна микробиота, което се свързва с възпаление на червата. Предишни данни са установили причинно-следствена връзка между H. pylori и стомашна язва и рак на стомаха. Данните, представени в това проучване, свързващи H. pylori с кръстосани взаимодействия с нормалната чревна микробиота, показват, че появата на медиирани от H. pylori заболявания при хората е по-сложна. Следователно допълнителни експерименти са силно оправдани, особено в ранния живот.

Нормалната чревна микробиота играе важна роля за регулирането на хомеостазата на метаболитния хормон в червата, което влияе върху развитието на нормалната телесна маса и мозъка. В допълнение, нормалната чревна микробиота също влияе върху резултата от колонизацията на H. pylori, като влияе върху промените в чревния метаболитен хормон и възпалението, предизвикано от H. pylori.

Методи

Подготовка на щам и инокулум на H. pylori

В това проучване е използван адаптиран за мишки C57BL/6 щам H. pylori, 298. Геномът на този щам е напълно секвениран 35. Накратко, H. pylori се култивира в инфузионен бульон за мозъчно сърце, допълнен с 0,4% екстракт от дрожди и 1% ß-циклодекстран (BHYC) в продължение на 4 дни при 37 ° C в овлажнен 10% CO2 инкубатор. Броят на бактериите се коригира до концентрацията от 10 9 бактерии на ml, за да се използва за инокулация на животни.

Животни и инокулация

За експерименти са използвани мъжки SPF и GF C57BL/6 мишки на възраст 4–6 седмици. Използвани са мъжки мишки, тъй като се съобщава, че показват по-висока честота на стомашен карцином от чревен тип в сравнение с женските 36. Всички мишки (SPF и GF) се поддържат в стерилни пластмасови изолатори в съоръжението на Националния център за борба с рака (NCC), поместено в Центъра за експериментална медицина SingHealth. Животните бяха държани на автоклавиран R36 Lactamin Chow (Lactamin, Швеция) и държани в условия на 12-часови леки цикли. Животните бяха разделени на четири групи по 12 (SPF, SPFH, GF и GFH). SPF и GF мишките за инокулация с H. pylori се гладуват през нощта и се хранят интрагастрично с 0,1 ml бактериална култура три пъти с интервал от 1 ден между тях. Контролните животни бяха инокулирани със стерилна BHYC среда по същия начин. Впоследствие мишките бяха жертвани 2 седмици (N = 3 на група), 8 седмици (N = 5) и 16 седмици (N = 5) след колонизация. Гастричните мишки се събират за култивиране на H. pylori, а плазмата се използва за анализ на хормони и цитокини.

Декларации за етика

Всички експериментални процедури бяха одобрени и проведени в съответствие с регламентите и насоките на институционалния комитет по грижи и употреба на животните SingHealth (IACUC; заявление № 2011/SHS/680) и Националния център за борба с рака в Сингапур, Комитет за биобезопасност на Singapur/Институционален комитет по биобезопасност на SingHealth (IBS; Заявление № 010/RBC/2011).

Колекция от плазмени проби

Кръв се взема в предварително охладени епруветки, покрити с EDTA и се смесва внимателно чрез инверсия. Кръвта се прехвърля в охладена епендорфска епруветка, съдържаща 2 М 4- (2-аминоетил) бензенсулфонил флуорид хидрохлорид (AEBSF, Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария) до крайна концентрация от 0,2 М и се разбърква внимателно. Епруветката се центрофугира при 3000 х g за 3 минути (4 ° С). Получената плазма се добавя към криотръба, съдържаща 1N HCl, за да се получи крайна концентрация от 0,1N и се съхранява при -80 ° C до анализ.

Култивирането на H. pylori от стомашен стомах на мишка се хомогенизира и инокулира върху плочи от шоколадов агар, допълнени със 7% лизирана конска кръв и, в случай на селективна среда, триметоприм (5 μg/ml), ванкомицин (10 μg/ml), налидиксинова киселина (20 μg/ml) и амфотерицин В (5 μg/ml) бяха добавени. Всички антибиотици са от Sigma-Aldrich Corporation (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Агаровите плочи бяха едновременно инкубирани при 37 ° С при овлажнени условия с 10% въглероден диоксид. Колониите, подобни на H. pylori, са потвърдени чрез положителност с тестове за уреаза, оксидаза и каталаза.

Мултиплекс анализ за чревни хормони и цитокини

Milliplex MAP Kit за мишка Метаболитни магнитни топчета (Каталожен номер MMHMAG-44K; Millipore Corp., MO, USA) е използван за количествено определяне на осем чревни хормони, които са важни регулатори на приема на храна, енергийните разходи и телесната маса: ацилиран (активен) грелин, лептин, активен амилин, инсулин, активен глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1), общ стомашен инхибиторен полипептид (GIP), общ пептид YY (PYY) и панкреатичен полипептид (PP). Панел с магнитни зърна на мишки цитокини/хемокини (Каталожен номер MPXMCYTO-70K; Millipore Corp., MO, USA) е използван за измерване на панел от 32 различни миши цитокини/хемокини. Използва се плазма и анализите се провеждат в съответствие с инструкциите на производителя. Измерването беше извършено на система Luminex 200 ™ със софтуер xPONENT ™, версия 3.1 (Luminex, Austin, TX, USA).

Статистически анализ