А Спличалова

* Отдел по имунология и гнотобиология, Институт по микробиология, Академия на науките на Чешката република, Нови Градек, Чехия

choerinum

I Требичавски

* Отдел по имунология и гнотобиология, Институт по микробиология, Академия на науките на Чешката република, Нови Градек, Чехия

V Рада

† Катедра по микробиология, хранене и диететика, Факултет по агробиология, храни и природни ресурси, Чешки университет за науки за живота Прага, Прага 6 - Сучдол, Чехия

Е Влкова

† Катедра по микробиология, хранене и диететика, Факултет по агробиология, храни и природни ресурси, Чешки университет за науки за живота Прага, Прага 6 - Сучдол, Чехия

U Sonnenborn

‡ Отдел за биологични изследвания, Ardeypharm GmbH, Хердеке, Германия

I Splichal

* Отдел по имунология и гнотобиология, Институт по микробиология, Академия на науките на Чешката република, Нови Градек, Чехия

Резюме

Въведение

Силно разнообразната микробиота на стомашно-чревния тракт на хора и животни формира уникална екосистема, която е силно здрава и способна да се конкурира с преходни и патогенни микроби [1,2]. Това свойство преди беше наречено колонизационна резистентност [3]. Чревната микробиота също съдържа мутуалистични бактериални щамове, които дават полза за здравето на гостоприемника и са известни като пробиотици [4,5]. Механизмите на тяхното действие не са добре разбрани. Смята се, че имуномодулацията, конкурентното изключване на патогени и производството на различни инхибиторни съединения (например органични киселини, микроцини) играят важна роля. Забраната на антибиотиците в животновъдството насърчава проучванията на пробиотичното действие и конкурентната намеса в чревната микробиота на домашни животни.

Стомашно-чревният тракт на новородените бозайници се колонизира от вагиналната и чревната микрофлора на майката по време на раждането и прогресира от стерилитет до плътна микробна колонизация през първите години от живота [6]. Бифидобактериите са редовен компонент на човешката и животинската чревна микробиота [7–9]. Те принадлежат към първите заселници в новороденото черво и достигат до 90% от микробиотата при кърмачета [10]. Новородените, родени чрез цезарово сечение и заместители на хранено мляко, имат различен състав на чревната микробиота, характеризиращ се с по-малък брой бифидобактерии [6]. Бифидобактериите присъстват в 10–100 пъти по-ниски концентрации в свинските черва, отколкото при хората [7,11–13]. Броят им се увеличава след хранене на прасета с хранителна добавка, съдържаща пребиотици [14].

Bifidobacterium choerinum е автохтонен бифидобактериален вид прасе, който е добре адаптиран към червата на предварително отбити прасенца и показва потенциални пробиотични свойства [15].

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) е пробиотичен щам на Е. coli [16], изолиран първоначално от изпражнения на човек, устойчив на инфекция с Shigella [17]. Той е ефективен за профилактика и лечение на дисмикробия и диария при новородени [18] и диария на телета при новородени [19]. Доказано е също така, че този щам предпазва прасетата от инфекция с ентеропатогенни бактерии [20,21]. EcN произвежда два микроцина, които са ефективни срещу ентеробактерии [22] и намалява инвазията на салмонела в ентероцитите [23].

Със своите опростени, контролирани и дефинирани микробиоти, гнотобиотичните животни са подходящи биологични модели за изследване на взаимодействията между бактерии и гостоприемници [24]. Тези свойства са използвани при проучвания на инфекция със салмонела [25,26].

В тази работа е сравнен възможният пробиотичен ефект на автохтонния B. choerinum с този на пробиотичния E. coli Nissle 1917. Гнотобиотичните прасета са използвани, за да се избегне какъвто и да е ефект от интериндивидуални вариации в чревната микрофлора и отглежданата среда [27]. Разпределението на бактериите, тяхната транслокация, защитният ефект срещу последваща инфекция с вирулентна Salmonella Typhimurium, клиничното състояние на експериментални прасенца и системно и локално производство на два възпалителни цитокина - хемокин, интерлевкин (IL) -8, провокафламентарен цитокин, тумор фактор на некроза (TNF) -α и противовъзпалителен цитокин, IL-10, бяха оценени.

Материали и методи

Животни

Миниатюрните свине майки, получени от Минесота, бяха третирани интрамускулно (i.m.) с 50 mg медроксипрогестерон ацетат (Depo-Promone; Pfizer Manufacturing Belgium, Puurs, Белгия) на 105-ия ден от бременността. Прасетата, лишени от коластра, без микроби са получени чрез хистеректомия под анестезия с халотан на 112-ия ден от бременността. Прасенцата се отглеждат в микробиологично контролирани изолатори от фибростъкло с положително налягане и се хранят до насита с автоклавна стерилизирана млечна диета, допълнена с минерали и витамини [28]. Прасенцата се проверяват за стерилност два пъти седмично и в деня на евтаназията чрез култивиране на ректални тампони аеробно и анаеробно и чрез методи за оцветяване [29]. Всички процедури с животни бяха одобрени от Комитета за защита и употреба на животните към Института по микробиология.

Бактериални щамове

PR4 е коменсален щам на B. choerinum, изолиран от фекалната флора на 8-седмични прасета от (LW × L) × Pn порода, използвайки модифициран агар от триптиказа-фитон-годишен (MTPY) [30]. Изолатът е идентифициран с помощта на произволна амплифицирана полиморфна ДНК-полимеразна верижна реакция (RAPD-PCR), съгласно Sakata et al. [31] и сравнен с щамове свински бифидобактерии от Немския ресурсен център за биологичен материал.

EcN е E. coli Nissle 1917 (EcN, серовар O6: K5: H1). Този чувствителен към серум невирулентен щам на Е. coli се използва като човешки и ветеринарен пробиотик [16].

LT2 е серумоустойчив щам LT2 на S. enterica serovar Typhimurium, причиняващ летален сепсис при прасенца без микроби [26].

Бактериални суспензии

За всеки експеримент се приготвят пресни култури от бактерии чрез култивиране при 37 ° С за една нощ. PR4 се култивира в анаеробна камера в 10 ml TPY бульон (Scharlau, Барселона, Испания). Клетките се събират чрез центрофугиране при 4000 ж за 10 минути. Пелетите се промиват два пъти с 0,05 М фосфатен буфер, рН 6,5, съдържащ 500 mg/l цистеин (PBC). EcN и LT2 се култивират върху месо-пептонови агарови склонове (основа на кръвен агар; Oxoid, Basingstoke, Великобритания). Бактериите бяха ресуспендирани до плътност 5 × 10 8 образуващи колонии единици (CFU)/ml и дадени на гнотобиотични прасета в млечна диета. Броят на CFU, изчислен чрез спектрофотометрия при 600 nm, беше проверен чрез метод на култивиране.

Колонизиране на прасета без бактерии

Едноседмични прасета без микроби са били орално асоциирани/заразени с 1 × 10 8 CFU бактерии в 5 ml млечна диета. Di-асоциираните прасета са заразени със S. Typhimurium 24 часа след асоциирането с PR4 или EcN, съответно. Всички експериментални прасета бяха евтаназирани 24 часа след последното третиране на бактерии чрез обезкървяване под халотанова анестезия. Контролната група без микроби е евтаназирана на същата възраст.

Бяха изследвани шест експериментални групи от едноседмични гнотобиотични прасета (пет прасета във всяка група) от пет хистеректомии на миниатюрни свине майки: (i) прасенца без микроби, (ii) прасета, моноасоциирани с LT2 (LT2 щам S. enterica serovar Typhimurium), (iii) прасета, моноасоциирани с PR4 (B. choerinum щам PR4), (iv) прасета, моноасоциирани с EcN (E. coli щам Nissle 1917), (v) прасета, диасоциирани с PR4 + LT2 и (vi) прасета LT2, свързани с EcN + LT2.

Разпространение на бактерии

Експериментални животни бяха евтаназирани и проби от периферна кръв, чревни промивки и хомогенизирани тъкани (от далак, мезентериални лимфни възли и черен дроб) бяха разредени серийно в PBC. Подходящите разреждания бяха прехвърлени в стерилни 60 mm чашки на Петри, които незабавно бяха напълнени със среда за бифидобактерии (TPY агар; Scharlau), допълнена със 100 mg/l мупироцин и 1 ml/l концентрирана ледена оцетна киселина [30]. Бифидобактериите се инкубират в анаеробен буркан (Anaerobic Plus System; Oxoid) в атмосфера на CO2/H2 (90/10%) при 37 ° С в продължение на 3 дни. Е. coli и Salmonella sp. са култивирани и изброени на 90 mm чаши на Петри с агар MacConkey (Merck, Дармщат, Германия) и агар Brilliant Green (Oxoid), съответно. Инокулираните плаки се инкубират аеробно при 37 ° С за 1 ден.

Промивът на илеума се получава чрез отрязване на 40-сантиметров сегмент на дисталната част на илеума, започващ от илеоцекалния отвор, и изплакване с 2 ml PBC. Промиването на дебелото черво се получава чрез поставяне на цялото дебело черво в чаша на Петри, нарязването му с ножица на къси парчета и добавяне на 4 ml PBC. Десеткратни серийни разреждания на проби се култивират, както по-горе, в зависимост от целевите бактерии. Коктейл с протеазен инхибитор (Roche, Mannheim, Германия) беше добавен към останалата част от промивките на червата за последващо откриване на цитокини, съгласно препоръките на производителя.

Детекция на цитокини чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

IL-8, IL-10 и TNF-α са оценени в цитрирана кръвна плазма (1200 ж, 10 минути, 8 ° C) или промивка на илеума (1500 ж, 20 минути, 8 ° C), приготвени, както е посочено по-горе, и филтрирани през 0,2 µm нитроцелулозни филтри (Sartorius, Göttingen, Германия). Всички проби с добавен коктейл с инхибитор на протеаза (Roche) бяха незабавно замразени и държани при -70 ° C, докато се използват. Сандвичът IL-8 ELISA с чувствителност 15 pg/ml е описан другаде [32]. IL-10 и TNF-α бяха открити със същата чувствителност от 15 pg/ml, използвайки свински IL-10 CytoSet ™ и свински TNF-α CytoSet ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), съгласно инструкциите на производителя. Анализите се извършват в 96-ямкови MaxiSorp ™ ELISA плаки (Nunc, Roskilde, Дания) и се измерват при 450 и 620 nm с четец за микроплаки Infinite M200 (Tecan, Grödig, Австрия). Резултатите бяха оценени с помощта на софтуера Magellan версия 6.3 (Tecan).

Статистически анализ

Стойностите на Log10 на CFU на бактериите бяха сравнени чрез t-тест на несдвоен студент. Прасетата, заразени със S. Typhimurium (LT2), служат само като контролна група за нивата на цитокини в плазмата и червата в ди-асоциирани групи (PR4 + LT2 и EcN + LT2). Различията между групите бяха сравнени чрез анализ на дисперсията (anova) с post-hoc теста на Dunnett. Разликите са оценени с помощта на InStat версия 3.10 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и се считат за значими, ако P Фиг. 1а). Разликите между броя на EcN в червата на моноасоциирани (EcN) и ди-асоциирани прасета (EcN + LT2) не са значителни (фиг. 1б). Както EcN, така и PR4 намаляват броя на салмонелите в илеума (P Фиг. 2). За разлика от това, PR4, нито EcN бактерии не са открити в кръвта 24 часа след перорално приложение. EcN също пречи на транслокацията на S. Typhimurium в мезентериални лимфни възли (P Фиг. 2): S. Typhimurium липсва в кръвта, черния дроб и белите дробове на EcN-di-свързани прасета. За разлика от това, всички прасета, свързани с PR4-ди, са страдали от септицемия.