Наоки Харада

1 отдел по приложни науки за живота, Висше училище за науки за живота и околната среда, Университет на префектура Осака, Сакай, Осака 5998531, Япония

Рио Ханаока

1 Отдел за приложни науки за живота, Висше училище за науки за живота и околната среда, Университет на префектура Осака, Сакай, Осака 5998531, Япония

Хироко Хориучи

1 отдел по приложни науки за живота, Висше училище за науки за живота и околната среда, Университет на префектура Осака, Сакай, Осака 5998531, Япония

Томоя Китакадзе

1 Отдел за приложни науки за живота, Висше училище за науки за живота и околната среда, Университет на префектура Осака, Сакай, Осака 5998531, Япония

Такакадзу Митани

1 Отдел за приложни науки за живота, Висше училище за науки за живота и околната среда, Университет на префектура Осака, Сакай, Осака 5998531, Япония

2 Интердисциплинарно висше училище за наука и технологии, Университет Шиншу, Камияна, Нагано 3994598, Япония

Хироши Инуи

3 Отдел по клинично хранене, Висше училище за цялостна рехабилитация, Университет на префектура Осака, Хабикино, Осака 5830872, Япония

Рьоичи Ямаджи

1 Отдел за приложни науки за живота, Висше училище за науки за живота и околната среда, Университет на префектура Осака, Сакай, Осака 5998531, Япония

Свързани данни

Резюме

Затлъстяването е глобален епидемичен проблем поради силната му връзка с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания 1, 2. Излишното натрупване на коремна висцерална мастна тъкан, диагностичен критерий за метаболитния синдром 2, увеличава разстройството в липидния метаболизъм, включително повишаване на нивата на чернодробните триглицериди 3. За разлика от това, подкожните мазнини намаляват честотата на сърдечно-съдови заболявания, което показва важността на разпределението на телесните мазнини 1, 2. Последните резултати показват, че промените в чревната микробиота са свързани с развитието на затлъстяване и с увеличаването на висцералната мастна маса 4, 5, 6, 7 .

Тестостеронът е мъжки сексуален хормон (андроген), който упражнява широк спектър от мъжки физиологични функции, като развитието на репродуктивни органи и появата на сексуално поведение 8, 9. Хипогонадизмът (т.е. ниско ниво на тестостерон) увеличава при мъжете риска от затлъстяване, сърдечно-съдови заболявания и дори смъртност 10, 11, 12, 13 чрез увеличаване на телесните мазнини, по-специално висцералните мазнини 14, 15; и лечението с тестостерон намалява количеството на висцералните мазнини 16. Терапиите за лишаване от андроген, като кастрация или аналог на летеинизиращ хормон-освобождаващ хормон за пациенти с рак на простатата, също насърчават развитието на затлъстяване 17, 18, 19. Тъй като нивото на биоактивния тестостерон в кръвта непрекъснато спада приблизително с 2% годишно след около 20 до 30-годишна възраст при мъжете 20, зависимият от възрастта спад на тестостерона е рисков фактор за възрастовото разпространение на коремното затлъстяване и свързаните с него заболявания в мъже 14, 20 .

Въпреки нарастващите доказателства както в клинични, така и в епидемиологични проучвания при хора 10, 11, 12, 13, механизмът, чрез който спадът на тестостерона предизвиква коремно затлъстяване, остава до голяма степен неясен. Физиологичните функции на тестостерона са широко анализирани в модели за кастрация на гризачи. За разлика от хората обаче, гризачите отслабват след кастрация поради намаляване на приема на храна 21, 22 и по този начин се счита, че кастрацията не причинява затлъстяване 23 .

Консумацията на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) променя липидния метаболизъм 24, 25 и също така засяга чревната микробиота, която участва в развитието на коремно затлъстяване 4. В настоящото проучване ние изследвахме взаимодействието между HFD и хипоандрогенизма при развитието на затлъстяване в модел на кастрирана мишка. Освен това ние изследвахме участието на чревната микробиота в индуцираното от хипогонадизма затлъстяване в този модел.

Резултати

Ефекти от кастрацията върху телесното тегло, приема на калории, ефективността на храненето, фекалното тегло и телесната температура при мишки

За да се изследват интерактивните ефекти на HFD и хипогонадизъм, мишките или са били кастрирани, или са били подложни на 8-седмична възраст и след това са били хранени с HFD в продължение на 16 седмици (експеримент 1). След загуба на тегло чрез кастрация, телесното тегло на кастрираните мишки надвишава това на мишките с фиктивна експлоатация (Фиг. 1а). От друга страна, общият прием на калории (т.е. прием на храна) в кастрираните мишки е намалял до приблизително 90% от този на контролните мишки (фиг. 1б, р = 0,020). Забележително е, че кастрацията постоянно увеличава кумулативната ефективност на хранене, изчислена чрез увеличаване на телесното тегло, разделено на прием на калории, след 14-седмична възраст (Фиг. 1в). За разлика от това, кастрацията води както до намалено телесно тегло, така и до прием на калории по време на експерименталния период при мишки, хранени със стандартна диета (SD) (експеримент 2, фиг. 1f, g, p фиг. 1h). Изходът на фекалиите е измерен като изсушено фекално тегло на 17-седмица и е установено, че е намален чрез кастрация както при HFD-, така и при SD-хранени мишки (Фиг. 1d, p = 0.018 и 1i, p = 0.0040). Забележително е, че степента на храносмилане, определена от съотношението на сухия прием на фекално тегло към храната, е била намалена чрез кастрация при HFD-хранените, но не е била засегната в SD-хранената група (Фиг. 1д, p = 0,0040 и 1j). Тези резултати показват, че индуцираният от кастрация хипогонадизъм причинява затлъстяване по зависим от HFD начин чрез увеличаване на ефективността на храненето, но не и чрез увеличаване на хиперфагия. В допълнение, метаболитните промени, придружени от намаляването на фекалното тегло, се препоръчват да бъдат отговорни за повишаването на ефективността на фуража чрез кастрация при HFD-хранени мишки.

влияе

(а,е) Криви на растежа за телесно тегло; (б,ж) Общ прием на калории, започващ след операция на 8-седмична възраст; (° С,з) Изчислена стойност на ефективността на фуража, започваща след операция на 8 седмична възраст до посоченото време; (д,i) Изсушено фекално тегло на ден; (д,j) Ефективност на храносмилането, изразена чрез разделяне на изсушеното фекално тегло на приема на калории. (n = 6, SD фиктивна; n = 6, SD кастрация; n = 7, HFD фиктивна; n = 7, HFD кастрация).

Ефекти на антибиотиците върху индуцираното от кастрация затлъстяване при мишки, хранени с HFD

След това оценихме участието на чревната микробиота в индуцирано от кастрация затлъстяване при мишки, хранени с HFD, тъй като техните производни представляват до половината от изсушеното фекално тегло 26. Кастрираните и подправени мишки се хранят с HFD и им се дават антибиотични коктейли чрез питейната вода, за да нарушат чревната микробиота (експеримент 3). Когато се предоставят антибиотици, кастрацията не успява да причини наднормено тегло (фиг. 2а) и кастрираните мишки имат по-нисък прием на калории (фиг. 2б, р = 0,022). При мишки, лекувани с антибиотици, индуцираното от кастрацията повишаване на ефективността на храненето е намалено (фиг. 2в) и те не показват намаляване както на фекалното тегло (фиг. 2г), така и на ефективността на храносмилането чрез кастрация (фиг. 2д) като в сравнение с мишки без антибиотици.

(а) Криви на растежа за телесно тегло; (б) Общ прием на калории, започващ след операция на 8-седмична възраст; (° С) Изчислена стойност на ефективността на фуража, започваща след операция на 8 седмична възраст до посоченото време; (д) Изсушено фекално тегло на ден; (д) Ефективност на храносмилането, изразена чрез разделяне на изсушеното фекално тегло на приема на калории на ден. (n = 8, фалшив и n = 6, кастрация).

Ефекти от кастрацията върху теглото на тъканите

Данните са изразени като средни стойности ± SEM. Статистическите разлики (* p Фиг. 1в) и увеличаването на телесното тегло са били видни по това време при HFD-хранени мишки (Фиг. 1а). Ефектите от кастрацията при мишки, хранени с HFD, са сравнени с тези при мишки, хранени с HFD плюс антибиотици, тъй като е известно, че HFD влияе силно върху липидния метаболизъм. Относителните тегла на органите на 13-седмичните мишки са обобщени в допълнителна таблица S1. На този ранен етап вече е настъпило увеличаване на мезентериалната и перинефричната/ретроперитонеална мастна тъкан чрез кастрация (p = 0,024 и p = 0,015, съответно), но подобни увеличения на мастната тъкан не са предизвикани в присъствието на антибиотици. В мезентериалната мазнина на мишки, хранени с HFD, експресиите на мастна триглицеридна липаза (Atgl) и хормоночувствителна липаза (Hsl), гени, отговорни за разграждането на липидите, бяха потиснати чрез кастрация (Фиг. 3а, p Таблица 2), ние също се обърнахме генната експресия се променя в черния дроб на 13-седмична възраст. При мишки без антибиотик, хранени с HFD, кастрацията значително повишава Cd36 (p = 0,0026) (фиг. 3b), което предполага засилване на приема на FFA. За разлика от мезентериалната мастна добавка с антибиотици няма почти никакъв ефект върху медиираните от кастрацията промени в експресията на чернодробните гени.

Ефекти от кастрацията върху чревната микробиота

Кастрационни ефекти, като затлъстяване, излишък на висцерални мазнини, повишаване нивата на чернодробните триглицериди, повишаване нивата на кръвната захар на гладно и намаляване на приема на фекално тегло към храната при мишки, хранени с HFD, не са наблюдавани, когато мишките са били лекувани с антибиотици. Антибиотиците драстично намаляват фекалните бактерии (но резистентните бактерии вероятно остават) и очевидно увеличават цекалното тегло (данните не са показани). Чревният микробиом влияе върху метаболизма на липидите в черния дроб и висцералната мастна маса, а не върху подкожната мастна маса 6, а консумацията на HFD критично променя състава на микробиотата на червата 30. Неотдавнашно проучване показа, че чревната микробиота се различава между мъжете и жените и участва в разпространението на свързани със секса заболявания 31. Установихме, че съотношението Firmicutes/Bacteroidetes и Lactobacillus spp. нивата бяха увеличени с кастрация при HFD-хранени мишки. Нашите резултати подкрепят схващането, че по-високото съотношение Firmicutes/Bacteroidetes и повишените нива на Lactobacillus spp. са свързани с разпространението на затлъстяването 5, 7, 27, 28 .

Затлъстяването при кастрирани мишки, хранени с HFD, е причинено от повишаването на ефективността на храненето, но не и от хиперфагия. По принцип кастрацията и овариектомията причиняват хипофагия и хиперфагия и водят до по-ниско и по-голямо наддаване на тегло при мъжки и женски гризачи, съответно 21, 41. Следователно, механизмът, лежащ в основата на индуцирането на затлъстяване чрез кастрация при HFD-хранени мишки, е различен от този при затлъстелите женски мишки, индуциран от овариектомия 41. Затлъстелите AR-KO мъжки мишки показват намалена физическа активност, придружена от намаляване на консумацията на O2 35. При мишки, хранени с HFD, кастрацията увеличава съотношението Firmicutes/Bacteroidetes, което е доказано, че увеличава капацитета за събиране на енергия от диета 5 и което намалява приема на фекално тегло към храна в нашето проучване. Взети заедно, тези резултати предполагат, че както намаляването на енергийните разходи, така и увеличаването на енергията, събрана от диетата, са свързани с повишаването на ефективността на фуража, индуцирано от хипогонадизъм.

Изглежда, че молекулярният механизъм, отговорен за натрупването на висцерална мазнина, разчита на намаляване на липолизата, а не на увеличаване на липогенезата. Atgl и Hsl в мезентериалната мазнина се потискат от кастрация при HFD-хранени мишки, но остават непроменени при антибиотично лечение. Значително намаляване на Hsl в интраперитонеалните WAT се наблюдава при глобални AR-KO затлъстели мишки 42. Тези резултати показват, че намалената липолиза във висцералните WATs е сходна при AR-KO мишките и в кастрационния HFD-хранен миши модел на затлъстелия фенотип. Обратно, в черния дроб на кастрирани мишки, хранени с HFD, триглицеридите се натрупват вероятно чрез увеличаване на липогенезата (т.е. повишаване на Fasn и Acc) и прием на FFA (т.е. увеличаване на Cd36). Тези промени в черния дроб не са засегнати от антибиотично лечение и са подобни на тези при специфичните за черния дроб AR-KO мишки (т.е. Srebp-1c, Acc, Scd1 и Pparg), които са със затлъстяване 40 .

Малката обиколка на бедрата увеличава риска както от сърдечни заболявания, така и от смъртност 43. Ниските нива на тестостерон също са рискови фактори за сърдечно-съдови заболявания и за съкратен живот 10, 11, 12. Нашите резултати показват, че кастрацията причинява загуба на квадрицепси и подколенни мускули, което води до намалена обиколка на бедрото, като всички те се появяват по HFD-зависим начин. Следователно намалената обиколка на бедрото може да бъде свързана с връзката между ниските нива на тестостерон и сърдечно-съдовите заболявания или съкратения живот. Резултатите от глобални AR-KO, специфични за мускулите AR-KO и кастрационни модели на мишки върху мускулна маса на крака и бедрото са несъвместими 22, 42, 44, 45, 46 и в това проучване мускулната маса на бедрото не е намалена от кастрация когато мишките са получавали антибиотици. В допълнение, нашите резултати показват, че лишаването от андроген причинява саркопенично затлъстяване по зависим от HFD начин.

Кастрацията повишава нивата на кръвната захар на гладно при мишки, хранени с HFD, докато кастрацията не влияе върху чувствителността на инсулин дори при мишки, хранени с HFD. Една от двете линии на AR-KO мишки със затлъстял фенотип показва намаляване на инсулиновата чувствителност 34; като има предвид, че другата линия не показва ефект върху инсулиновата чувствителност 33, 42. В това проучване чувствителността към инсулин (след 6 часа бързо) е непроменена, но глюкозата на гладно (след 15 часа гладна) се увеличава с кастрация при HFD-хранени мишки. От друга страна, базовите плазмени нива на инсулин (след 4 часа бързо) леко намаляват с кастрация при HFD-хранени мишки (р = 0,27, таблица 2). Нашите резултати могат да предполагат, че секрецията на инсулин е била нарушена от кастрация при HFD-хранени мишки. Тази възможност се подкрепя от публикувани ръкописи, предполагащи, че тестостеронът участва във функцията на β-клетките 47, 48 .

Моделите AR-KO мишки са полезни за анализ на ефектите на андрогените. Въпреки това, глобалните AR-KO мъжки мишки се раждат с подобни на женски външни гениталии и малки, неспаднали тестиси 36, което поражда известно съмнение, че фенотипите на AR-KO мишките изцяло представляват този на свързания с възрастта спад на тестостерона. В настоящото проучване използвахме мишки C57BL/6J, които са широко използван инбреден щам за конструиране на генетично модифицирани мишки. Ние заключаваме, че моделът на затлъстяване, предизвикан от диета и кастрация, ще бъде мощен инструмент за изследване на заболявания, свързани с хипогонадизъм.

Методи

Животни

Диети

Съставите на SD и HFD са изброени в допълнителна таблица S2. Казеин, царевично нишесте, α-царевично нишесте, царевично масло, свинска мас, телешки лой, целулоза, минерална смес и витаминна смес са получени от CLEA Япония. Съставките се смесват и прахообразните диети се съхраняват при -20 ° C до употреба. Прясна храна се дава на животните 3 пъти седмично. Антибиотици (1 g/L натриев ампицилин, 0,5 g/L ванкомицин хидрохлорид, 1 g/L неомицин сулфат и 1 g/L метронидазол) се прилагат през питейната вода след кастрация.

Измерване на нивата на инсулин, триглицериди, FFA и холестерол

Плазмените нива на инсулин се определят с помощта на инсулинов комплект ELISA (Shibayagi, Gunma, Япония). Липидите бяха извлечени както от черния дроб, така и от изпражненията по метода на Folch’s 50. Нивата на триглицеридите в черния дроб, плазмата и изпражненията се определят с триглицеридния E-тест (Wako, Osaka, Japan). Плазмените, фекалните и чернодробните нива на холестерола се определят с холестерол Е-тест (Wako).

PCR в реално време

Общата РНК се изолира от тъканите и сДНК се синтезира, използвайки праймери ReverTra Ace (TOYOBO, Osaka Japan) и dT20. Геномна ДНК беше извлечена от фекални проби с помощта на циркониеви зърна (ϕ 5 mm и ϕ 0,2 mm) с мулти-топчен шокер (MB755U (S), Yasui Kikai, Осака, Япония) и QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Количествената RT-PCR беше извършена с помощта на SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA Bio, Shiga, Япония) с различните набори праймери (допълнителна таблица S3). Програмата за PCR беше 95 ° C, 60 секунди, последвани от 40 цикъла (2 стъпки: 95 ° C, 30 секунди; отгряване и удължаване, 30 секунди или 3 стъпки; 95 ° C, 30 секунди; отгряване, 30 секунди; удължаване, 72 ° С, 30 сек). Относителната експресия на целевите гени се изчислява, като се използва стойността на Ct, приспособена към стандартна крива, която е получена от поредица разредени cDNA и нормализирана от тази на контролния ген (например β-актин или 16 S rRNA за общите бактерии).

Статистически анализ

Данните бяха анализирани чрез t-тест на Student или еднопосочен вариационен анализ, последван от post-hoc тестване на Tukey-Kramer, използвайки JMP статистически софтуер версия 8.0.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Данните са показани като средни стойности ± SEM и се взема предвид статистическа разлика между групите, когато p (722K, pdf)

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Grants-in-Aid (25450176) за научни изследвания (за Н.Х.) от Японското общество за промоция на науката. Благодарим на Масахиро Огава (Университет на префектура Осака) за техническата му помощ.

Бележки под линия

Авторите не декларират конкуриращи се финансови интереси.