1 Катедра по ендокринология, Първата свързана болница на Китайския университет в Анхуей, Хефей 230031, Китай

shenzhu

2 Институт по диабет, Академия Анхуей Китайска медицина, Хефей 230012, Китай

3 Катедра по инфекциозни болести, Първата асоциирана болница на Университета по китайска медицина в Анхуей, Хефей 230031, Китай

4 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230039, Китай

5 Катедра за компютърен център, Първата свързана болница на Китайския университет в Анхуей, Хефей 230031, Китай

6 Технологичен департамент, Университет по китайска медицина в Анхуей, Хефей 230038, Китай

7 Катедра по фармация, Първата свързана болница на Китайския университет в Анхуей, Хефей 230031, Китай

Резюме

Обективен. Целта на това проучване е да се изследва значението на китайската билкова формула (CHF) Shenzhu tiaopi Granule (STG) при захарен диабет тип 2 (T2DM) и да се обсъдят механизмите, чрез които STG регулира чревната микробиота. Метод. Плъховете Goto-Kakizaki (GK) и плъховете Wistar (W), съответстващи на възрастта, бяха аклиматизирани за 1 седмица. Плъховете GK бяха разделени на случаен принцип в 3 групи и орално измервани с физиологичен разтвор (моделна група, М), акарбоза (акарбозна група, А) и STG (гранули от CHF група, G; компонентът на тази формула включва Codonopsis pilosula, Rhizoma Atractylodis, Пинелия, Кокос пория, Pericarpium Citri Reticulatae, Coptis chinensis Franch, и Пуерария). W плъховете бяха орално изследвани с физиологичен разтвор (контролна група, С). Времето за наблюдение беше 8 седмици. Тествани са теглото, нивото на кръвната глюкоза на гладно (FBG) и нивата на липидите в кръвта. 16S rRNA гените в V3-V4 региона бяха секвенирани и структурата на чревната микробиота беше анализирана. Резултати. В сравнение с C, M показва значителни разлики в кръвната глюкоза, чревната микробиота и др. (P

1. Въведение

Наскоро някои учени предполагат, че чревната микробиота е вторият геном на човешкото тяло. Съобщава се, че съставът и балансът на чревната микробиота играят решаваща роля за човешкото здраве [1]. Нашите познания за функцията на чревната микробиота се увеличиха. Чревната микробиота може да допринесе за появата на метаболитна и енергийно-метаболитна дисрегулация [2, 3]. Доказано е, че захарният диабет тип 2 (T2DM) е свързан с установяването и поддържането на дисбаланс в микробиотата; този дисбаланс се характеризира предимно с повишено изобилие от Enterococcus, Enterobacter, и Betaproteobacteria и намалено изобилие от Bifidobacterium, Лактобацилус, клас Clostridia и Faecalibacterium prausnitzii в проучвания върху животни [4–7].

Много проучвания показват, че чревната микробиота модулира глюкозната хомеостаза след лечение с метформин, акарбоза, GLP-1, вилдаглиптин, SGL-2 и др. [8–14]. Акарбозата инхибира алфа глюкозидазата в проксималното тънко черво. Неговият механизъм на действие е съобразен с този на китайската диета и по този начин акарбозата се използва широко в Китай [15]. Benli SU [10] установява, че лечението с акарбоза увеличава изобилието на червата Bifidobacterium longum при китайски пациенти с T2DM. Тези проучвания демонстрират, че модулацията на чревната микробиота допринася за индуцирано от акарбоза намаляване на кръвната глюкоза.

В продължение на много години китайските билкови формули (CHF) се използват за лечение на много заболявания, като диабет. Няколко проучвания показват, че CHF ефективно намалява нивата на кръвната глюкоза и гликирания хемоглобин A1c (HbA1c) при пациенти с T2DM и пациенти с предиабет [16–19]. В предишните ни изследвания Shenzhu tiaopi Granule (STG), която е CHF, беше тествана при пациенти с предиабет и T2DM. Показано е, че STG предотвратява инсулиновата резистентност и намалява активността на HbA1c [19]. Все пак дали съставът на чревната микробиота участва в STG-медиираното регулиране на кръвната глюкоза все още не е ясно. Следователно в това проучване са изследвани възможните метаболитни подобрения и модулиращи дейности на чревната микробиота на CHF STG.

2. Методи и материали

2.1. Експерименти с животни
2.2. Вземане и измерване на проби

След 8 седмици животните се анестезират с натриев пентобарбитал (60 mg/kg) и кръвни проби се събират чрез проби от пробиване на коремната аорта, за да се получи изолиран серум чрез центрофугиране при 4000 об/мин за 10 минути. След това се събира съдържанието на дебелото черво.

Теглото на тялото се измерва всяка седмица. Нивата на FBG, триглицеридите (TG), общия холестерол (TC), липопротеиновия холестерол с висока плътност (HDL-C) и липопротеиновия холестерол с ниска плътност (LDL-C) при плъховете се определят с автоматичен биохимичен анализатор (Olympus AU640 ).

2.3. Illumina MiSeq Пиросеквениране на чревната микробиота

Всички последователности бяха предоставени на GenBank под номер за присъединяване SRP091598. Последователностите със средни резултати на Phred по-ниски от 20, последователности, съдържащи двусмислени бази, и последователности с дължини по-къси от 150 bp бяха премахнати. Четенията на сдвоени краища са събрани с помощта на FLASH [20]. Ефективните припокривания на последователности, по-дълги от 10 bp без несъответствие в праймерите, бяха събрани според тяхната последователност на припокриване. Таксономичната класификация на OTU е проведена от BLAST, търсейки представителните последователности спрямо базата данни Greengene [21], използвайки най-доброто попадение [22]. Подрязаните последователности бяха качени в „Количествени прозрения в микробната екология“ (QIIME, v1.8.0) за допълнителен анализ.

2.4. Статистика и анализ

Всички данни са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност и са били подложени на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) или тест за най-малко значими разлики на Fisher (LSD), използвайки SPSS 20.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ) . P-стойност Фигура 1

Сравнение на телесното тегло между различните групи.


Сравнение на нивата на FBG между различните групи.


Сравнение на нивата на TC и HDL между различните групи.

3.2. Структура на общността на чревната микробиота

За да се оценят промените в чревната микробиотна общност, 16S rRNA генно секвениране на променливи области V4-V5 на бактериите от четирите групи беше проведено с помощта на платформи Illumina MiSeq. Произвеждаме общо 2 132 752 последователности със средно 49 219 последователности за проба от С група, 51 127 последователности за проба от М група, 50 763 последователности за проба от група А и 68 116 последователности за проба от група G. Тридесет и шест последователности от фекални проби имаха средна дължина 420

460 базови двойки (Фигура 4). Резултатите са представени като оперативни таксономични единици (OTU). Данните са били събрани с хомологична гранична стойност от 97% спрямо базата данни Greengene. Общо 15 квалифицирани последователности (> 0,001%) са групирани в 3517 бактериални OTU и 243 OTU са открити само в С групата, 69 OTU са намерени само в М групата, 96 OTU са намерени само в А група и 413 OTU са конкретно идентифицирани в групата G (Фигура 5).


Карта на разпределение на дължината на последователността.


Диаграма на Вен на общите и уникални OTU в четирите групи.

След разреждането дълбочината на секвениране на всички проби се изчислява като текуща дълбочина на секвениране. Кривите на Шанън обхващат редки нови фенотипове и по-голямата част от разнообразието (Фигура 6). На ниво OTU, богатството на общността, измерено чрез индекса на Шанън, е значително увеличено в групата М в сравнение с тази в групата С (Р Фигура 6

Анализ на кривата на Шанън на различните групи на ниво OTU.


Индекс на Шанън за различните групи на ниво OTU.

Впоследствие е конструиран контролиран PLS-DA модел, при който М групата е отделена от С групата с PLS1, докато G и A групите са разделени от М групата чрез PC2 (Фигура 8). Използвани са неконтролирани многовариантни статистически методи, включително графики за оценка на PCoA, за сравняване на отчетливите разлики в изобилието на OTU сред групите M и C по QIIME. Всяка точка в участъка представлява чревната микробиота на една проба. Освен това, ние забелязахме, че леченията, прилагани в групите G и A, променят бактериалната структура на червата на мишката, както е оценено от PCoA. Разстоянието между G групите е по-голямо от това между A групите. Структурата на чревната микробиота на групите G и A показва същата тенденция (Фигура 9). Непретегленото на базата на UniFrac неметрично многомерно мащабиране (NMDS) разкрива ясно групиране на състава на микробиотата във всяка група сред четирите групи. G групите показаха различен състав на микробиота, който се групира по различен начин от този на останалите три групи (Фигура 10).


График на дискриминантния анализ на частични най-малки квадрати.


Резултат от основния координационен анализ на чревната микробиота сред четирите групи.


Неметрична многомерна скалираща оценка, базирана на непретеглените разстояния на UniFrac на микробиотата.

3.3. Модулация на ключовата общност на чревната микробиота след лечение

Основната фила, открита в анализа на разнообразието на чревната микробиота, включва Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Tenericutes и Actinobacteria, като допринася съответно 73,6%, 11,7%, 10,0%, 2,8% и 0,8% от всички OTU. Firmicutes е най-разпространеният вид във всички проби, като представлява 72,5% (в групата G), 71,7% (в групата A), 70,9% (в групата M) и 81,6% (в групата C) (Фигура 11). Увеличение на относителното изобилие на Bacteroidetes и намаляване на Firmicutes бяха открити в М групата в сравнение със С групата (P 0,05). Междувременно няма значителни разлики между G и A групите (P> 0,05). В сравнение с М групата, G групата показва значително обогатено относително изобилие на Bacteroidetes (P 0,05) (Фигура 13).


Състав изобилие от чревна микробиота на ниво филум.


Относително изобилие от бактериална фила, открита във фекални проби.


Съотношение Firmicutes/Bacteroidetes в четирите групи.

На ниво род съставът на микробиотите значително варира сред четирите групи. Относителното изобилие на Алобакулум, Clostridiales, Ruminococcaceae, Лактобацилус, S24-7 и Desulfovibrionaceae са допринесли съответно 17,8%, 16,1%, 11,9%, 10,1%, 9,9% и 7,1% от общата популация на фекалните микробиоти. Намаляване на Алобакулум и Лактобацилус е открит в М група в сравнение с тези в С група. В сравнение с групата М, групите A и G показват значително увеличено количество (P Фигура 14

Относително изобилие от родове, открити във фекалното съдържание.

Методът LEfSe е използван за определяне на диференциално относително обилните таксони на микробиота и организми със значителни разлики в изобилието на гени сред четирите групи. Дължината на хистограмата показва степента на влияние на различни организми. Алфа стойността на непараметричния факториален тест за сбор от ранг на Крускал-Уолис достигна значителното ниво от 2.0. Относителното изобилие на значително различните видове беше определено въз основа на резултатите от LEfSe (P Фигура 15

LEfSe сравнение на чревната микробиота между четирите групи.


Таксономична кладограма, получена от LEfSe анализа на четирите групи. Жълтите възли не представляват значителни междугрупови разлики. Червените и зелените възли показват значителни междугрупови разлики.


Таксономична кладограма, получена от LEfSe анализ, сравняващ A и G групите. Жълтите възли не представляват значителни междугрупови разлики. Червените и зелените възли показват междугрупови разлики.

За по-нататъшно идентифициране на промените в фекалната микробиота в модела на диабетните плъхове, 50 рода с относително изобилие бяха представени чрез топлинна карта и групирани на ниво род. Очевидно родовете са наблюдавани на различни нива в четирите групи. Psychrobacter, Копробацилус, Finegoldia, Epulopisclum, Dehalcbacterium, Ротия, Turicibacter, Трихокок, Стрептококи, Smb53, Десулфовибрио, Анаеростипес, Колинзела, Актиномици, Стафилококи, Дорея, Jeotgalicoccus, и Анаерофустис са били увеличени в М групата, докато относителното изобилие от Акермансия, Алистипес, Руминокок, Копрокок, Клостридий, Парапревотела, и Лакноспира са намалени (Таблица 1). A и G групите показаха обратното на промените в тези видове. По този начин, топлинната карта на относителното изобилие от видове микробиота, променена от лечението в групата G, показва разликите в чревните бактериални състави в сравнение с тези в групата А. Картата на топлината показва, че групата G е била по-тясно свързана с групата C, отколкото групата A (Фигура 18).


Топлинна карта на фекалиите на ниво род. Червените и зелените цветове показват високи и ниски стойности на процента четения, класифицирани в този ранг.

4. Дискусия