Асоциация, Висше училище за науки за живота, Университет Тохоку, Сендай, Япония

слюноотделянето

* До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: [email protected]

Асоциация, Висше училище за науки за живота, Университет Тохоку, Сендай, Япония

Фигури

Резюме

Цитат: Watanabe H, Mizunami M (2007) Хлебарка Павлов: Класическо кондициониране на слюноотделянето при насекомо. PLoS ONE 2 (6): e529. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000529

Академичен редактор: Алдо Рустичини, Университет на Минесота, Съединени американски щати

Получено: 8 февруари 2007 г .; Прието: 19 май 2007 г .; Публикувано: 13 юни 2007 г.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено с безвъзмездни средства от Министерството на образованието, науката, културата, спорта и технологиите на Япония и изследователски стипендии на Японското общество за насърчаване на науката за млади учени.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Отделянето на слюнка за подпомагане на първоначалното дъвчене, храносмилането и поглъщането на храна е важна физиологична функция, която се среща при много гръбначни и безгръбначни. Павлов [1] съобщава за класическо обуславяне на слюноотделянето при кучета преди около век и тази форма на кондициониране е най-известният пример за класическо кондициониране. Всъщност много от основните принципи на класическото обуславяне са установени чрез изучаване на тази важна форма на обучение. Доколкото ни е известно обаче, кондициониране на слюноотделяне е съобщено само при кучета и хора [2], [3]. Въпреки огромните усилия на Павлов и неговите наследници [1], [4] - [6], основните нервни механизми в него остават неуловими поради сложността на мозъка на бозайниците.

Насекомите са били използвани като подходящи модели за изучаване на невронната основа на ученето и паметта [7] - [10]. Проучвания, използващи оперантни и класически процедури за кондициониране, показват, че хлебарки имат отлични способности за обучение [11] - [15]. Например, хлебарки показаха отлично учебно представяне в парадигма за определяне на повод, в която визуалният контекст определя случайността между обонятелните CS (кондициониращи стимули) и вкусовите US (безусловни стимули) [16].

Слюноотделянето се регулира от вегетативната нервна система. При бозайниците слюнчените жлези се снабдяват с хоринергични парасимпатикови и адренергични симпатикови нерви, които контролират секрецията на слюнка без протеини и богата на протеини, съответно [17] - [19]. При насекоми като хлебарки Periplaneta americana слюнчените жлези се снабдяват с дорпаминергичен слюнчен неврон (SN1) и GABAnergic слюнчен неврон (SN2) на подоезофагеалния ганглий и с няколко серотонергични неврони, принадлежащи към стоматогастралната нервна система [20] - [23]. Допаминергичните и серотонинергичните неврони контролират секрецията на съответно безпротеинова и богата на протеини слюнка [22].

По-рано показахме, че слюнчените неврони на хлебарки показват забележим отговор на миризма след кондициониращи опити, при които миризмата (CS) е съчетана с разтвор на захароза (US), но че тези неврони показват само много слаби реакции на миризмата, представена самостоятелно, без да се сдвояват с разтвор на захароза [24]. Резултатите демонстрират кондициониране на активността на слюнчените неврони, но остава да се получат преки доказателства за кондициониране на слюноотделяне. В това проучване изследвахме ефектите от кондициониращите опити върху слюнчените реакции на миризми и установихме, че миризмата, сдвоена с разтвор на захароза, предизвиква повишаване на нивото на слюноотделяне. Резултатите от това проучване показват, че класическото кондициониране на слюноотделянето е повсеместно сред различните видове.

Методи

Насекоми

Възрастни мъжки хлебарки, Periplaneta americana, са получени от лабораторна колония, поддържана при светло-тъмен цикъл (LD 12:12) при 26-28 ° C. Една или две седмици преди началото на експеримента, група от 20–30 хлебарки беше поставена в камера. За да се засили мотивацията за усвояване на разтвор на захароза, хлебарки са били хранени с диета без захар и питейна вода ad libitum.

Измерване на слюноотделяне в отговор на обонятелен или вкусов стимул

Процедурата за измерване на нивото на слюноотделяне е модифицирана от тази, използвана в предишното ни проучване [24]. Хлебарка беше обезболена за кратко, задържайки се върху покрития с восък съд с вентрална страна нагоре, след като крилата му бяха отстранени. Краката, шията и гръбната страна на корема бяха фиксирани с ниско топящ се восък, а антените бяха обездвижени чрез скоби. Сдържаният хлебарка можеше да движи свободно устата си. Обездвижените хлебарки се държат на стайна температура в продължение на 1-2 часа.

Слюнката се секретира в устната кухина през слюнчения канал. За да се изложи слюнченият канал, се отстраняват кожичките на шията и лабиума. Слюнченият канал беше прерязан и след това дисталният пън-пън беше вкаран в пластмасова камера с отвор в горната част. Върхът на пластмасовата камера е покрит с бял вазелин, за да се предотврати изтичането на слюнка (фиг. 1А). Измерването започва> 10 минути след завършване на настройката на препарата за стабилизиране на слюноотделянето. Течността, отделяна от канала към пластмасовата камера, се изтегля в пластмасов капиляр на всеки 1 минута и дължината на колоната на течността се измерва за изчисляване на обема на слюнката (фиг. 1А). Нивото на слюноотделяне се поддържа постоянно при хлебарки [24].

Процедура на сензорна стимулация и кондициониране

Системата за непрекъснат въздушен поток, използвана за подаване на миризма на антена, е описана по-рано [25]. Накратко, въздухът, преминал през малка камера, съдържаща парче филтърна хартия, се доставя към антената чрез задействане на соленоиден клапан, без да се променя скоростта на потока. Филтърната хартия беше напоена с 40 µl мента, ванилия или ябълкова есенция. Въздухът около антената непрекъснато се изсмуква чрез вакуумна система. За вкусово стимулиране, капчица (4 µl) от 500 mM разтвор на захароза или 5 M разтвор на натриев хлорид беше представена в устата.

Процедурата за кондициониране е променена от описаната по-рано [24]. Обездвижените хлебарки са получили пет изпитания за сдвояване P +/V - или P -/V + (фиг. 1Б) или опити за сдвояване назад (P фигура 1 В) с интервали от 5 минути. Едно проучване за сдвояване P +/V - се състои от представяне на миризма на мента 3 секунди преди представянето на разтвор на захароза и последващо представяне на миризма на ванилия без сдвояване с разтвор на захароза (фиг. 1В). Едно проучване на P−/V + сдвояване напред се състоя от несдвоено представяне на миризма на мента и последващо представяне на миризма на ванилия 3 секунди преди представянето на разтвор на захароза. Едно проучване за сдвояване на P +/V - се състои от представяне на миризма на мента 3 секунди след представянето на разтвор на захароза и последващо несдвоено представяне на ванилия (фиг. 1С). В един контролен експеримент (опити само с CS) ментовата миризма и миризмата на ванилия бяха представени последователно пет пъти с интервали от 5 минути (фиг. 1D). В друг контролен експеримент (опити само в САЩ), разтворът на захароза беше представен пет пъти с интервали от 10 минути (фиг. 1Е). Във всички експерименти продължителността на представяне на миризмата беше 4 секунди.

За да се изследва задържането на кондициониращия ефект, реакциите на слюноотделяне към миризми се измерват на 30 минути след кондициониране при някои групи хлебарки и на 1 ден след кондициониране в други групи. Хлебарки получиха 4-секундно представяне на миризми от мента, ванилия и ябълка (контрол) с интервали от 6 минути. Последователността на представяне на миризми беше рандомизирана между индивидите и данните от индивидите бяха събрани за статистическа оценка. В експерименти за изследване на еднодневно задържане на кондициониращия ефект, имобилизираните хлебарки се държат във влажна камера при стайна температура.

Резултати

Реакция на слюноотделяне при обонятелна или вкусова стимулация

В една група хлебарки мента (плътна линия), ванилия (прекъсната линия) и миризми от ябълки (пунктирана линия) бяха представени в продължение на 4 секунди към антена с интервали от 6 минути (A). В други две групи хлебарки, 4 ul от 500 mM разтвор на захароза (плътна линия) или 5 M разтвор на натриев хлорид (пунктирана линия) бяха представени в устата (C). Количеството слюнка, секретирано от слюнчения канал, се измерва на всеки 1 min и стойностите са показани като средни стойности ± s. M. За статистическа оценка количеството слюнка, секретирано за период от 2 минути след появата на обонятелна (B) или вкусова (D) стимулация (R; черна лента), е сравнено с това преди стимулация (R0; бяла лента). Звездичките показват нивото на значимост (** 0,05; WCX-тест).

Класическо кондициониране на слюноотделянето

Две групи хлебарки са били подложени на пет серии от изпитвания за кондициониране P +/V - и са измерени промените в нивата на слюноотделяне в отговор на стимулация на мента, ванилия или ябълка на 30 минути след опити за кондициониране в една група хлебарки и на 1 ден след изпитвания за кондициониране в друга група (Фиг. 3А-С). Други две групи хлебарки са били подложени на пет комплекта изпитвания за сдвояване P−/V + и реакциите на слюноотделяне на тези миризми са измерени на 30 минути след опити за кондициониране в една група и на 1 ден след опити за кондициониране в друга група (Фиг. 3D – F).

В една група хлебарки мента (плътна линия), ванилия (прекъсната линия) и ябълкови миризми (пунктирана линия) бяха представени на антена на 30 минути след пет P +/V− (A) или P−/V + (D) напред -пробни сдвояване. Миризмите бяха представени за 4 секунди с интервали от 6 минути. Количеството слюнка, секретирано от слюнчения канал, се измерва на всеки 1 min и стойностите са показани като средни стойности ± s. M. За статистическа оценка количеството слюнка, отделено за период от 2 минути след началото на стимулацията (R; черна лента), се сравнява с това преди стимулация (R0; бяла лента) за 30 минути (B, E) или за 1 ден (C, F) след пет P +/V- или P−/V + пробни сдвоявания. Звездичките показват нивото на значимост (** 0,05; WCX-тест).

Повишаване на нивото на слюноотделяне се наблюдава, когато мента или мирис на ванилия се представя на антена на 30 минути след P +/V− (фиг. 3A) или P−/V + (фиг. 3D), съответно изпитвания за сдвояване напред. Повишените нива на слюноотделяне продължиха около 2 минути. За да се оцени статистически реакциите на слюноотделяне, нивото на слюноотделяне за период от 2 минути след стимулация на миризмата се сравнява с това преди стимулация на миризмата. Мирисът на мента или ванилия предизвиква значително увеличение на нивата на слюноотделяне на 30 минути след P +/V− (Фиг. 3B; N = 23; мента: P 0,05, T = 115; 1 ден: N = 16; P> 0,05, T = 59,5) или P−/V + (фиг. 3E, F; мента; 30 минути: N = 23; P> 0,05, T = 105; 1 ден: N = 17; P> 0,05, T = 73) напред- сдвояване проби, съответно.

Контролни експерименти

При три групи хлебарки промените в нивата на слюноотделяне в отговор на мирис на мента, ванилия или ябълка са измерени на 30 минути след изпитвания за сдвояване P +/V - назад (Фиг. 4А) или CS (Фиг. 4В) или на 40 минути след само опити в САЩ (фиг. 4С). Отговорите на слюноотделяне при стимулиране на миризмата са статистически оценени чрез сравняване на количествата слюнка, отделяни по време на 2-минутен период след стимулиране на миризмата (R) с това преди стимулация (R0), чрез теста на Wilcoxon.

Във всяка от трите групи хлебарки количеството слюнка, отделяно в отговор на миризма на мента, ванилия и ябълка, беше измерено на 30 минути след P +/V - назад (A), CS само (B) или само US (C) опити. Количествата слюнка се измерват на всеки 1 min и стойностите са показани като средни стойности ± s. M. За статистическа оценка количеството слюнка, секретирано за 2-минутен период след началото на обонятелната стимулация (R; черна лента), се сравнява с това преди стимулация (R0; бяла лента). Звездичките показват нивото на значимост (** 0,05; WCX-тест).

Мирисът на мента или ванилия не предизвиква промяна в нивото на слюноотделяне в никоя от трите контролни групи, а именно P +/V - група за сдвояване назад (N = 15; мента: P> 0,05, T = 29; ванилия: P> 0,05, T = 48), CS само група (N = 17; мента: P> 0,05, T = 70; ванилия: P> 0,05, T = 65) и група самостоятелно в САЩ (N = 17; мента: P> 0,05, T = 60,5; ванилия: Р> 0,05, Т = 69). Миризмата на ябълка индуцира значително увеличение на нивото на слюноотделяне във всички контролни групи (P +/V− група за сдвояване назад, N = 15; P 15 минути са възможни при хлебарки [38] - [40]. Целта на следващия ни експеримент е да се изследват областите на мозъка и субезофагеалният ганглий, участващи в кондиционирането на слюноотделянето.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: MM HW. Извършва експериментите: HW. Анализирани данни: HW. Написа хартията: MM HW.