Хюн Хва Лим

1 Департамент по храните и храненето, Университет Кюнг Хи, Сеул, Корея.

Су Джин Ян

2 Департамент по храните и храненето и изследователския институт по човешка екология, Национален университет Chonnam, Gwangju, Корея.

Юрий Ким

3 Катедра по хранителна наука и управление на храните, Университет Ewha Womans, Сеул, Корея.

Myoungsook Lee

4 Департамент по храните и храненето и Изследователски институт по наука за затлъстяването, Университет за жени Sungshin, Сеул, Корея.

Юнсук Лим

1 Департамент по храните и храненето, Университет Кюнг Хи, Сеул, Корея.

Резюме

Въведение

Повечето съвременни лекарства против затлъстяване имат потенциални странични ефекти. По този начин много проучвания са фокусирани върху естествени съединения, които нямат неблагоприятни странични ефекти, но имат потенциални ползи за пациентите със затлъстяване. Черничевите листа и плодове са част от традиционната източна медицина от дълго време и се предполага, че са полезни за предотвратяване или лечение на затлъстяване, диабет и дислипидемия. 12-16 Предишно проучване съобщава, че етаноловият екстракт от черничеви листа намалява телесното тегло и действа като антагонист на концентриращ меланин хормон-1 при индуцирани от диета затлъстели мишки. 12 Няколко проучвания също така демонстрират, че черничевите листа инхибират активирането на ядрения фактор капа-лек верижен усилвател на активирани В клетки (NF-κB), индуциран от тумор некротизиращ фактор алфа (TNF-α) в съдовите ендотелни клетки 17 и контролират възпалителното реакция и оксидативен стрес чрез потискане на производството на реактивни вещества нитрити и тиобарбитурова киселина (TBA) в кръвта и тъканите. 18 Антоцианините в плодовете на черница могат да изчистят свободните радикали и да инхибират окисляването на липопротеините с ниска плътност (LDL). 19 Освен това плодът от черница подобрява възпалението в стимулирани от липополизахарид (LPS) миши първични макрофаги и артритни плъхове. 20,21

Към днешна дата по-голямата част от съществуващите терапевтични доказателства се основават на експерименти с единична доза или вид черничеви листа или плодове, а полезните ефекти от черничев лист и плодов коктейл не са изследвани преди това при изследвания за затлъстяване. Предположихме, че коктейлът от черница и плодове може да има благоприятни ефекти върху предотвратяването или лечението на затлъстяването чрез модулиране на възпалителния отговор и оксидативния стрес. За да се провери тази хипотеза, отговорите на затлъстяването, възпалението и оксидативния стрес на различни съотношения и дози екстракт от черница (MLE) и екстракт от плодове на черница (MFE) бяха сравнени в модел на гризачи с високо съдържание на мазнини (HF), предизвикано от диета.

Материали и методи

Растителни материали и екстракция

Листата и плодовете на черница са събрани от Центъра за развитие и технологии на селското стопанство YangPyeong (YangPyeong-gun, Южна Корея). Изсушените листа и плодове се екстрахират със 70% етанол. Сместа се филтрува, изпарява се в ротационен изпарител и се лиофилизира. Добивът е съответно 20% и 28% от изходното сухо тегло на черничевите листа и плодове.

Животни

Мъжки мишки C57BL/6 (Orient Bio, Seongnam, Южна Корея) бяха настанени при постоянна температура (22 ± 1 ° C) с 12 h тъмен/светъл цикъл с достъп до вода и храна ad libitum. След едноседмичен период на аклимация, мишките бяха разделени на случаен принцип в две групи: (1) контролна диета и (2) високочестотна диета. Всяка група е хранена или с контролна диета (D12450B, 10% kcal мазнини; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) или HF диета (D12451, 45% kcal мазнини; Research Diets), съответно в продължение на 9 седмици.

Експериментален дизайн

След затлъстяване, индуцирано от HF диета в продължение на 9 седмици, мишките бяха разделени на осем групи (n = 6 на група), както следва: (1) постно контролиране (CON), (2) HF диета, индуцирано затлъстяване (HF), (3) високочестотна диета при съотношение 1: 1 на MLE и MFE в доза 200 (L1: 1), (4) 500 (M1: 1) и (5) 1000 (H1: 1) mg/kg на ден и (6) високочестотна диета при съотношение 2: 1 на MLE и MFE в доза 200 (L2: 1), (7) 500 (M2: 1) и (8) 1000 (H2: 1) mg/kg на ден. Леченията се прилагат ежедневно чрез стомашна сонда в продължение на 12 седмици. По време на лечебния период се записват телесно тегло и прием на храна. В края на експерименталния период животните се анестезират с интраперитонеален Zoletil/Rompun след гладуване през цялата нощ и кръвта се събира от посткавална вена. След това тъканите бяха изолирани и съхранявани при -80 ° C до анализ. Този протокол от проучването е съобразен с Националните здравни ръководни принципи за грижа и използване на лабораторни животни и е одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към университета в Кюнг Хи.

Тест за интраперитонеален глюкозен толеранс

След периода на лечение мишките бяха подложени на 16-часово гладуване за една нощ. След това разтвор на глюкоза (2 g/kg) се инжектира интраперитонеално. Нивата на кръвната глюкоза се измерват на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след глюкозното предизвикателство с помощта на глюкомер.

Биохимичен анализ

Плазмените триглицериди (TG), общият холестерол (TC) и липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL-C) са измервани ензимно с помощта на търговски комплекти (Bio Clinical System, Anyang, Южна Корея). Атерогенният индекс (AI) се изчислява по: AI = (плазмен TC - плазмен HDL-C)/плазмен HDL-C.

Измерване на липидната пероксидация

Нивата на малондиалдехид (MDA) бяха измерени като маркер за липидна пероксидация, използвайки метода TBA. Прибавят се чернодробни хомогенати (200 μL) с 0,15 М калиев хлориден буфер, 0,2 ml 8,1% натриев додецил сулфат, 3 ml 20% оцетна киселина – 0,8% TBA смес и 600 μL вода и след това се загряват при 95 ° C за 60 минути. След охлаждане върху лед се добавят 1 ml вода и 5 ml смес от н-бутанол и пиридин (15: 1, v/v) и се центрофугират при 2500 g в продължение на 10 минути. Абсорбцията на супернатантите беше измерена при 532 nm.

Хистологичен анализ

Бяха подготвени хистологични срези и оцветени с хематоксилин и еозин. Оцветени срезове бяха наблюдавани с помощта на оптичен микроскоп (HS-100). Средният размер на епидидималните адипоцити е измерен с помощта на софтуера Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Western blot анализ

Приготвят се чернодробни лизати и протеините се разделят чрез електрофореза на полиакриламиден гел на натриев додецил сулфат и се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден флуорид. Мембраните бяха блокирани и инкубирани с антитела срещу TNF-α, интерлевкин-1β (IL-1β), фосфо-ядрен фактор-инхибитор на каппа В алфа (p-IKBα), медно-цинкова супероксидна дисмутаза (Cu-ZnSOD), глицералдехид -3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH; Санта Круз Биотехнология, Санта Круз, Калифорния, САЩ), С-реактивен протеин (CRP), глутатион пероксидаза (Gpx) (Abcam, Кеймбридж, Обединено кралство), индуцируема азотна оксидна синтаза (iNOS), хем оксигеназа-1 (HO-1) и манган SOD (MnSOD; Stressgen, Victoria, BC, Канада). След това мембраните бяха изложени на конюгирано с пероксидаза от хрян вторично антитяло (Santa Cruz Biotechnology). Откриването се извършва с помощта на засилен хемилуминесцентен реагент (Santa Cruz Biotechnology). Western blot изображенията се получават с луминисцентен анализатор на изображения (Gbox; Syngene, Frederick, MD, USA) и интензитетите на лентите се определят количествено. Денситометричният анализ оценява относителното количество протеинова лента и количествено определя резултатите по отношение на оптичната плътност. Нивата на експресия на протеин бяха нормализирани до стойности за GAPDH.

Статистически анализ

маса 1.

Ефекти от комбинираното лечение на черничеви листа и плодови екстракти върху наддаването на телесно тегло, приема на храна и коефициента му на ефективност при мишки C57BL/6, хранени с високо съдържание на мазнини

Наддаване на телесно тегло (g за 12 седмици) Прием на храна (g/ден) FER (%)
CON4.42 ± 0.25 a 2,44 ± 0,072,16 ± 0,12 a
HF12.80 ± 0.85 d 2,41 ± 0,125,95 ± 0,68 d
L1: 16,93 ± 0,82 abc 2,27 ± 0,013.64 ± 0.43 abc
М1: 17,73 ± 1,01 пр.н.е. 2,22 ± 0,094.15 ± 0.56 пр.н.е.
Н1: 18,59 ± 0,82 c 2,41 ± 0,064,23 ± 0,39 пр.н.е.
L2: 15,92 ± 1,29 abc 2,22 ± 0,013,17 ± 0,68 abc
М2: 15,60 ± 0,92 ab 2,50 ± 0,352,79 ± 0,53 ab
Н2: 18,40 ± 0,80 пр.н.е. 2,16 ± 0,014.62 ± 0.43 cd

Стойностите са средни ± SEM (n = 6).

листа

Таблица 2.

Плазмени липидни профили в мишки C57BL/6, третирани с комбинирани обработки на черничеви листа и плодови екстракти

TC (mg/dL) HDL-C (mg/dL) TG (mg/dL) AI
CON106,02 ± 9,06 a 65,92 ± 5,6269,98 ± 5,46 a 0,66 ± 0,03 a
HF163,38 ± 8,77 b 62,03 ± 6,38154,37 ± 14,51 б 1,54 ± 0,32 b
L1: 1137,90 ± 6,60 ab 69,11 ± 6,5887,14 ± 19,39 a 1,09 ± 0,15 ab
М1: 1130,54 ± 12,98 ab 74,76 ± 5,5082,90 ± 13,25 а 0,79 ± 0,21 a
Н1: 1137,46 ± 9,24 ab 67,29 ± 5,0765,43 ± 7,45 a 0,94 ± 0,22 a
L2: 1143,99 ± 13,81 б 73,86 ± 5,6290,20 ± 9,47 a 0,95 ± 0,12 a
М2: 1137,28 ± 13,40 ab 77,04 ± 8,8593,37 ± 11,62 a 0,74 ± 0,10 a
Н2: 1140,19 ± 4,74 ab 75,17 ± 1,9193,32 ± 12,69 а 0,91 ± 0,10 a

Стойностите са средни ± SEM (n = 6).

Таблица 3.

Ефекти от комбинираното лечение на черничеви листа и плодови екстракти върху липидната пероксидация в черния дроб на мишки C57BL/6, хранени с високо съдържание на мазнини

Концентрация на MDA (nM)
CON18,51 ± 0,79 a
HF25,31 ± 3,38 b
L1: 117,22 ± 1,11 a
М1: 117,98 ± 1,93 a
Н1: 118,00 ± 1,93 a
L2: 117,33 ± 2,66 a
М2: 118,04 ± 1,75 а
Н2: 117,46 ± 1,71 a

Стойностите са средни ± SEM (n = 6).

Хистологичен анализ на (А) черен дроб (оригинално увеличение, 40 ×) и (Б) епидидимални мастни тъкани (първоначално увеличение, 20 ×) и (° С) количествено определяне на размера на епидидималните адипоцити. Стойностите са средни ± SEM (n = 6). abcd Различните букви в дадена променлива са значително различни при P Фиг. 3). Нивата на CRP в черния дроб са били по-високи в групата с HF, отколкото тези на постните контроли, но нивата са значително намалени след MLE и MFE лечения. Нивата на CRP в черния дроб в група M2: 1 са най-ниските сред всички групи на лечение. Зрелите нива на IL-1β в черния дроб са по-високи в групата на HF в сравнение с тези в постните контроли. За разлика от това, нивата на IL-1β в черния дроб са намалели до контролните нива във всички групи на лечение. Въпреки че нивата на iNOS в черния дроб не се различават значително между постните контролни групи и групата на СН, той значително намалява в групите L2: 1 и M2: 1. Нивата на p-IKBα в черния дроб се повишават в групата с HF в сравнение с тези в постните контроли, но тези нива намаляват значително във всички групи на лечение. Намаляването на нивата на p-IKBα е по-голямо в групите със съотношение 2: 1, отколкото в групите със съотношение 1: 1. Нивата на p-IKBα в групата M2: 1 са най-ниските сред всички групи на лечение.

Маркери за оксидативен стрес в черния дроб на мишки C57BL/6 с комбинирано лечение на черница и плодови екстракти: (А) представителни Western blots за маркери за оксидативен стрес. (Б) Денситометричен анализ на хем оксигеназа-1 (HO-1), манганова супероксиддисмутаза (MnSOD) и медно-цинков SOD (CuZnSOD). Нивата на експресия на протеин бяха нормализирани до стойности за GAPDH. Стойностите са средни ± SEM (n = 6). abc Различните букви в дадена променлива се различават значително при P 22 и играят важна роля в управлението на диабета чрез регулиране на чернодробната глюконеогенеза, 23 което предполага антидиабетен ефект за черничевите листа. Флавоноидите в черничевите листа намаляват плазмения TG, TC и LDL холестерол при хиперлипидемични плъхове, предизвикани от диета с висок холестерол. 24,25 Освен това плодовете от черница подобряват липидните профили в кръвта и метаболизма на липидите при хиперлипидемични плъхове. 26 Нашите резултати по подобен начин показаха, че комбинираните MLE и MFE лечения значително намаляват плазмените нива на TG и намаляват атерогенността, както е показано чрез намален AI в сравнение с тези в HF групата, с изключение на L1: 1. Тези резултати показват, че комбинираното лечение с MLE и MFE може да има адитивни или синергични ползи за подобряване на метаболизма на TG и холестерола при затлъстели плъхове.

Повишените депа на TG в черния дроб причиняват допълнително натрупване на мазнини при хиперлипидемични мишки. 27 Нашето хистологично изследване показа, че черният дроб в HF групата е развил макровезикуларна и микровезикуларна стеатоза, докато плъховете, хранени в съотношение 1: 1 и 2: 1 с MLE и MFE, показват намалено натрупване на мазнини в черния дроб. Освен това хипертрофията на адипоцитите беше инхибирана от леченията с MLE и MFE, което беше в съответствие с предишните констатации, че трите билки (Melissa officinalis L., Morus alba L. и Artemisia capillaris Thunb) намаляват мастната тъкан чрез инхибиране на ангиогенезата при хранително индуцирано затлъстяване мишки. 28 Тези резултати предполагат, че лечението с MLE и MFE ефективно потиска хипертрофията на затлъстяването на черния дроб и адипоцитите.

Нашето предишно проучване демонстрира, че комбинираното лечение с MLE и MFE притежава по-високи ефекти на затлъстяване от тези при еднократно лечение с MLE. По този начин, в настоящото проучване, различни съотношения и дози MLE и MFE в комбинация са приложени към HF-индуцирани затлъстели мишки, за да се определи най-доброто съотношение и доза за лечение на затлъстяване и намаляване на свързаните с него стресори. В заключение, комбинираните MLE и MFE лечения бяха ефективни срещу затлъстяването и свързаното с него възпаление и оксидативен стрес. Съотношението 2: 1 на MLE и MFE е по-добро от съотношението 1: 1 за биохимичните подобрения. Средната доза (500 mg/kg на ден) сред групите със съотношение 2: 1 е най-добрата за лечение на затлъстяването и свързаното с него възпаление и оксидативен стрес. Освен това високата доза (1000 mg/kg на ден) не може да бъде препоръчана поради селективен неблагоприятен ефект върху затлъстяването. Взети заедно, предполагаме, че комбинираното лечение с MLE и MFE подобрява няколко вида стресори, участващи в възпаление и оксидативен стрес при индуцирани от HF диети със затлъстяване.

Признание

Това проучване беше подкрепено от безвъзмездни средства от Корейския институт за планиране и оценка на технологиите в храните, земеделието, горите и рибарството (811003-03-1-SB120).