Резюме

Идиопатичната калциева нефролитиаза (ICN) е многофакторно заболяване, което включва различни причинно-следствени фактори, които могат да бъдат диетични (прием на протеини, калций, натрий, липиди и др.) (1), околната среда (околни и професионални условия на живот, начин на живот, излагане на слънце, качество на водата и др.) (2) и генетични (3). Случаят за хранителна и екологична причина за камъни се основава на следните наблюдения: (1) Бъбречната каменна болест е била необичайна преди началото на 20-ти век, но честотата й постоянно се е увеличавала; (2) каменната болест е по-често срещана в богатите общности (4) и съществува положителна връзка между доходите на глава от населението и разходите за храна на глава от населението; и (3) докладвани са редица взаимовръзки между диетични/фактори на околната среда и рискови фактори за уриниране на камъни (4–6).

тръбни

Работната хипотеза, която беше изследвана в това проучване, е, че нефротоксините (т.е. промишлените замърсители) увреждат бъбречния тубулен епител (TE), насърчавайки кристалната адхезия на калциевия оксалат (CaOx) и благоприятствайки задържането на кристали и литогенезата и че това може да съвпадне с изключително скромни бъбречни лезии, предизвикани от много ниска доза на токсина, например при условия, които приличат на „нормално“ излагане на токсина на човека от околната среда.

Разработен е модел на плъх за изследване на тази хипотеза, базиран на моделите, използвани за изследване на CaOx кристалогенезата (чрез индуциране на хронична хипероксалурия чрез прилагане на перорален етиленгликол [EG]) и нефротоксичност, индуцирана от индустриални токсини (чрез интраперитонеално приложение на HCBD, типичен нефротоксин [13]). HCBD не е чисто експериментален нефротоксин, тъй като е широко разпространен в биосферата, особено в замърсените индустриални зони (14–18). Щамът Wistar от плъхове е избран да разработи модела вместо по-често използвания плъх Sprague-Dawley, тъй като реагира на EG по същия начин и с почти същата чувствителност по отношение на образуването на бъбречни кристали (19), но имахме по-добър знания за неговата бъбречна чувствителност към HCBD.

Материали и методи

Мъжки плъхове Wistar от албинос (200 ± 10 g; Harlan, San Pietro al Natisone, UD, Италия) бяха поставени в пластмасови клетки, при контролирани условия на температура (20 ° C) и влажност (40 до 60%), с тъмно светлинен цикъл от 12 часа; хранени са със стандартна диета за гризачи (Nuova Zoofarm, Падуа, Италия) и им е разрешено да пият чешмяна вода ad libitum от време -7 d до време 0 d. Те бяха разпределени в четири различни групи: (1) Група 1 (n = 15) получи EG, (2) група 2 (n = 15) получи EG и HCBD 10 mg/kg телесно тегло, (3) група 3 (n = 15) получи EG и HCBD 25 mg/kg телесно тегло и (4) група 4 (n = 15) получи EG и HCBD 50 mg/kg телесно тегло.

Графикът на изследването е показан на Фигура 1. Двадесет и четиричасовите експериментални периоди са посочени като Т, последвано от число, от Т7 до Т21. Всеки период започваше в 13 часа. и завърши в 13:00 следващият ден. В началото на Т7 и Т14, веднага след събирането на урина от предходния период, HCBD/царевично масло се инжектира интраперитонеално. Когато плъховете бяха убити, това беше направено в началото на периода, след приключване на събирането на урина от предишния период. Урината се събираше в края на посочените периоди, от 8 до 13 часа. При Т0 плъховете бяха настанени в метаболитни клетки за събиране на урина. EG се прилага перорално в чешмяна вода (0,5 об./Об.) От Т1 през целия експеримент в продължение на 3 седмици; на Т7 и Т14, HCBD (чистота> 97%; Fluka, Buchs, Швейцария) се прилага интраперитонеално на плъховете в групи 2, 3 и 4; HCBD се разтваря в царевично масло (5 ml/kg телесно тегло). На плъховете от група 1 се дава само царевично масло. Плъховете бяха убити чрез обезкървяване под анестезия с диетилов етер на Т8 (3 плъха/група), Т10 (3 плъха/група), Т15 (3 плъха/група) и Т21 (всички останали плъхове).

Експериментален дизайн (вижте текста за подробности).

От Т6 до края на проучването плъховете са настанени в отделни метаболитни клетки. Пет часа проби от изпразнена урина бяха събрани на Т0, Т6, Т7, Т8, Т9, Т10, Т11, Т13, Т14, Т15, Т16, Т17, Т18 и Т20. Тъй като открихме отлична корелация както за калций в урината, така и за оксалат, между съответните им стойности, получени от 24-часови (изразени като μmol/24 h) и 5-часови сутрешни колекции (изразени като μmol/mmol креатинин; калциурия P 2 (морфометричен анализ с помощта на Image Pro-Plus 5.1; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) .За трансмисионна електронна микроскопия (TEM), ултратънки срезове бяха изрязани от вградени в Epon тъканни блокове, оцветени с уранил ацетат, последван от оловен цитрат, и след това изследвани с Електронен микроскоп Hitachi H-700.

Статистически анализи

Статистическият анализ на данните включва еднопосочен ANOVA с корекция на Bonferroni за групови сравнения и ANOVA за многократни измервания.

Резултати

Проучвания върху урината

Пероралното приложение на EG 0,5% не индуцира значителна CaOx кристалурия по време на 3-седмичния период на проучването от Т1 до Т20 (група 1), но повишава оксалурията до 200 μmol/mmol креатинин (Таблица 1). При Т6 оксалурията в четирите експериментални рамена е значително по-висока от тази в изходното ниво (Т0; Р = 0,001 до 0,000) и остава стабилна след това до Т20 (Таблица 1). Няма статистически значима разлика в оксалурията между четирите експериментални групи по всяко време на проучването, от Т6 до Т20. Лечението само с EG 0,5% (група 1) също не предизвиква статистически значими вариации в протеинурията и ензимурията през цялото проучване (Фигура 2).

Екскреция на урина с протеин (A) и ангиотензин-конвертиращ ензим (ACE) и N-ацетил-β-глюкозаминидаза (NAG; B) след приложение на хексахлоро-1: 3-бутадиен (HCBD) при плъхове, консумирали етилен гликол (EG). Протеин в урината (U.prot), ACE в урината (U.ACE) и NAG в урината (U.NAG) при плъхове от група 1, които са получавали само EG, са в нормални граници. Графиката в А показва данни за T6, T7 (първо инжектиране на HCBD), T8 и T9. Графиките в B показват данни при T7. Подобна цифра в периода Т13 до Т16 съвпада с второто приложение на HCBD (Т14). Стойностите се изразяват като средна стойност и SEM. * Стойности, значително различни от изходното ниво.

PH на урината и екскреция на оксалат и калций при T0, T6, T13 и T20 a

При плъхове, които са получили EG, HCBD 10 mg/kg телесно тегло не предизвиква анормална протеинурия или NAG ензимурия след двете инжекции (група 1), а само умерена АСЕ ензимурия (Фигура 2В). При по-високите дози (25 и 50 mg/kg телесно тегло, съответно групи 3 и 4), той причинява преходно, дозозависимо покачване на протеинурията след двете инжекции (което регресира за 3 дни); преходно, дозозависимо увеличение на екскрецията на АСЕ с урината; и преходно увеличение на екскрецията на NAG (при най-високата доза, 50 mg/kg телесно тегло; Фигура 2).

Калциурията и рН на урината не се повлияват от нито едно лечение и остават постоянни по време на изпитването от Т0 до Т20 (Таблица 1). Кристалурията, състояща се главно от CaOx дихидрат, се появи при всички плъхове в групи 2, 3 и 4 през първите 24 часа след всяко приложение на HCBD и постепенно избледнява през следващите 3 до 4 дни (Таблици 2 и 3).

CaOx кристалурия a

Плъхове с CaOx кристалурия a

В предварителните експерименти две инжекции на HCBD (10, 25 и 50 mg/kg телесно тегло) на 7 дни, без съпътстващо приложение на ЕГ, не бяха в състояние да предизвикат кристалурия, но при най-високите дози (25 и 50 mg/kg телесно тегло) те след двете инжекции причиниха почти същите промени в протеинурията и ензимурията, както при плъхове от група 3 и 4 (Фигура 3). Оксалурията, калциурията и рН на урината не са засегнати.

Екскреция на урина с протеин (A) и ACE и NAG (B) след приложение на HCBD при плъхове, които не консумират EG. Тези данни произхождат от предварително проучване, проведено за създаване на експериментални условия върху 10 животни на група.

Морфологично изследване

При плъхове, лекувани само с EG (група 1), микроскопията със светлина и поляризирана светлина и ТЕМ върху бъбреците, отстранени при T8, T10, T15 и T21 d, не разкрива значителни морфологични аномалии или кристални отлагания. Нещо повече, апоптотичният индекс, измерен чрез оцветяване с TUNEL, е без значение по всяко време.

Ядра с кондензация на хроматин в проксимални тубулни епителни клетки. Стрелката сочи към едно от тези ядра (група 3, T21 d, трансмисионна електронна микроскопия). Увеличение, × 5000.

Апоптотичен индекс в четирите експериментални групи при Т21. * Статистически значимо по-високо от група 1.

Терминална деоксинуклеотидил трансфераза, медиирана dUTP ник-енд маркиране - положителни епителни клетки в проксимални и дистални тубули. Стрелките показват апоптотични клетки (група 3, T21 d). Увеличение, × 50.

В предварителните експерименти с HCBD (10, 25 и 50 mg/kg телесно тегло), светлинната микроскопия и ТЕМ след две инжекции на HCBD, извършени на 7 дни, без никакво съпътстващо приложение на ЕГ, разкри много подобни снимки на описаните по-горе, със същите „ отговор, свързан с дозата “, но със забележителното изключение, че не са наблюдавани TUNEL-позитивни клетки дори 7 дни след второто приложение на HCBD при най-високите дози (25 и 50 mg/kg телесно тегло). Не се наблюдава отлагане на кристали в бъбреците.

Дискусия

Това проучване показва, че при леки хипероксалурични плъхове кристалурията се предизвиква дори от много скромна тръбна инсулт, причинена от HCBD, както е показано при плъховете от група 2. Това тубулно увреждане може да индуцира кристалурия при наличие на лека хипероксалурия вече е доказано от Kumar et al. (10) и Hackett et al. (11) като се използват многократни приложения на много високи дози гентамицин, но това причинява далеч по-тежки тубулни увреждания, характеризиращи се с проксимална тубулна некроза с фокално оголване на епитела.

Нашият експериментален дизайн обхваща различни условия, от много ниска степен до тежка тубулна токсичност. Що се отнася до хистологичните и ензимните промени, приложението на EG не е имало влошаващ ефект върху токсичността на HCBD, с изключението на апоптозата. Всъщност асоциирането на хипероксалурия с по-високите дози HCBD (25 и 50 mg/kg телесно тегло) води до апоптоза на тубуларните клетки, но нито един от тях няма апоптотичен ефект сам по себе си. Проучванията in vitro показват, че концентрациите на оксалати при границата на метастабилност за CaOx причиняват апоптоза на ТЕ клетки (9), но тези концентрации вероятно са били по-високи от интралуминалните концентрации на оксалат, които вероятно са били достигнати в нашия in vivo модел. Към днешна дата не се съобщава за ефект на HCBD върху апоптозата на бъбречните клетки и той не разкрива никаква апоптотична активност в нашето предварително проучване, когато се прилага без EG. Нашите данни следователно предполагат синергичен ефект на EG и HCBD върху апоптозата. Като предполагаем механизъм за това, намаляването на вътреклетъчния глутатион чрез HCBD (24) може да наруши клетъчното буфериране на реактивни кислородни форми, което се произвежда от оксалат-индуцирания оксидативен стрес (25,26). Подобна небалансирана наличност на реактивни кислородни видове е потенциален спусък на апоптозата на бъбречните тубуларни клетки (27).

Съществуват корелативни доказателства, които предполагат, че апоптозата може да увеличи образуването на кристали и адхезията към бъбречните тубуларни клетки (9,28,29). Профилите на апоптоза и кристалурия в нашия модел обаче са различни, тъй като кристалурията явно се предизвиква дори от много леките лезии, които се отразяват в повишена АСЕ ензимурия без никаква апоптоза, както в група 2. Освен това кристалурията е очевидна още след първо инжектиране на HCBD, което не е в състояние да индуцира апоптоза на бъбречните клетки. Следователно, апоптозата изглежда не играе роля в кристалурията, която се наблюдава в този модел. Освен това, липсата на интралуминални кристали в нашия модел изглежда противоречи на каквато и да е роля за бъбречната тубулна клетъчна апоптоза в адхезията на кристали. Ако обаче апоптозата в нашия експеримент е засегнала клетки, където или когато не е имало кристали, това може да обясни липсата на свързване на кристали и отлагане на интраренални кристали. Следователно са необходими по-нататъшни проучвания, за да се потвърди каквато и да е in vivo роля на апоптозата на ТЕ клетките върху литогенезата и нашият модел може да бъде полезен в този смисъл.

Четирите експериментални групи не се различават по отношение на оксалурия, калциурия или рН на урината и няма промяна в тези параметри по време на проучването, особено в периодите непосредствено след приложението на HCBD. Следователно ние вярваме, че кристалурията в нашия модел се дължи на отделянето на някаква тръбна клетъчна мембрана (на която ACE ензимурията е маркер), както се предполага от Khan et al. (30), а не чрез промяна в оксалурията или пренасищането на урината.

Нашето откриване на вътребъбречни кристали в този модел е в противоречие с резултата в подобен модел, използващ гентамицин и EG (10,11). Вече споменахме разликите между двата модела и предположихме, че нашият предизвиква бъбречните тубули много по-сериозно. Всъщност не предизвикахме денудация на ТЕ, за която се твърди, че играе важна роля при излагането на тръбната базална мембрана, към която се прилепват кристалите CaOx (9). Въпреки това, в светлината на констатациите, съобщени от Evan et al. (31), които подкрепят интерстициалния произход на плаката на Рандал и нейната роля за насърчаване на генезиса и растежа на камъни в бъбречното легенче, предположението, че кристалите трябва да се придържат към ТЕ, за да растат и образуват клъстер, може да не е от значение за образуването на камъни.

Според нашите данни може да бъде предложен двустепенен (или двустранен) модел: При рискови метаболитни рискови състояния (първата стъпка, т.е. фина хипероксалурия под определен праг), които са необходими, но не са достатъчни за появата на нефролитиаза, има задействащо събитие (втора стъпка), което причинява образуването на камъни. Предполагаме, че това се отнася за състояние, подобно на човешкото ICN. Всъщност Evans et al. (31) не са показали никакви кристали CaOx върху бъбречни биопсии от пациенти, които са имали ICN, които могат да представят лека (маргинална) хронична хипероксалурия сред многото рискови фактори за бъбречни камъни. Сценарият е различен при плъховете, които се предизвикват с много по-високи приема на EG, при които оксалурията е достатъчно висока, за да предизвика спонтанна кристализация в бъбреците. Подобно обстоятелство изглежда по-близко до това, наблюдавано при пациенти с първична хипероксалурия.

Заключение

Вярваме, че за да обясним патогенезата на камъните в ICN, трябва да запълним празнината между предразполагащите камъни състояния (напр. Хиперкалциурия, хипероксалурия, хипоцитратурия, по-ниска активност на инхибиране на кристализацията и агрегацията), които обикновено са хронични, и камъка -формиращ епизод, който е спорадичен. Предполага се, че нещо се случва да изведе деликатното уринарно равновесие от равновесие, като по този начин се стигне до епизод на бъбречните камъни. Такова предполагаемо събитие може да бъде излагане на събитие, което може да увреди ТЕ и по този начин да улесни адхезията на кристали или да предизвика остра кристалурия. Дали индустриалните/екологични нефротоксини като HCBD действително играят роля, все още е силно спекулативно и се нуждае от специфични проучвания.

Благодарности

Част от експериментите на тази статия бяха представени на деветата среща на Евролитическото общество EULIS, втори симпозиум на Eulis, 11-14 юни 2003 г., Истанбул, Турция, и публикувани в абстрактна форма (Exp Urol 31: 32, 2003).