Alltalents T Murahwa 1,2 *, Monalisa T Manhanzva 1,2 и Babill Stray-Pedersen 3

методи

1 Катедра по медицински лабораторни науки, Университет в Зимбабве Колеж по здравни науки, Avondale, Harare, Зимбабве

2 Институт по инфекциозни болести и молекулярна медицина, Факултет по здравни науки, Университет в Кейптаун, Катедра по медицинска вирусология, Кейптаун, Южна Африка

3 Институт по клинична медицина и Катедра по акушерство и гинекология, Rikshospitalet, Осло, Университетска болница, Норвегия

* Автор-кореспондент: Alltalents T Murahwa
Катедра по медицински лабораторни науки
Университет в Зимбабве Колеж по здравни науки
Авондейл, Хараре
Зимбабве
Тел: 00263-779-136342
Електронна поща: [имейл защитен]

Дата на получаване: 27 юни 2016 г .; Приета дата: 08 юли 2016 г .; Дата на публикуване: 13 юли 2016 г.

Цитат: Murahwa AT, Manhanzva MT, Stray-Pedersen B (2016) Молекулярни методи за откриване на бета- и гама-папиломавируси: Преглед. J Infect Dis Ther 4: 289. doi: 10.4172/2332-0877.1000289

Посетете за още свързани статии на адрес Списание за инфекциозни болести и терапия

Резюме

Натрупващи доказателства за родовете бета и гама човешки папиломен вирус (HPV), показват връзката му с немеланомни кожни ракови заболявания (NMSC). Съвременните методи за откриване на HPV в клинични проби са на молекулярна основа. Разнообразие от молекулярни техники, разработени за диагностика на HPV; съсредоточете се повече върху откриването на типове HPV на лигавицата. Разработени са ограничен брой анализи за откриване и генотип на кожни HPV. Тези анализи откриват част от видовете HPV, замесени в кожни лезии с различна чувствителност и специфичност. Противоречивата литература за разпространението на HPV в NMSC е резултат от противоречивите диагностични стандарти. Настоящият преглед обсъжда наличните методи за откриване и генотипиране на HPV с акцент върху кожни генотипове на HPV. Тази информация ще предостави на изследователите съответния избор на молекулярни методи, приложими за епидемиологични изследвания. Крайната цел е да се направят автоматизирани, бързи и по-евтини молекулярни подходи за бедни ресурси.

Ключови думи

Човешки папилома вирус; Лезии; Рак на кожата; Карцином

Въведение

HPV е най-често замесеният вирус при човешки злокачествени заболявания с 5,2% от всички видове рак, дължащи се на HPV инфекция [1]. Световната здравна организация (СЗО) показа, че около 9-13% (

630 милиона) от световното население има HPV инфекция [2]. Участието на HPV в рака на маточната шийка, пениса, устната кухина, гениталиите и ларинкса и кожните лезии като кожни брадавици, плоскоклетъчен карцином (SCC) и базалноклетъчен карцином (BCC) е документирано широко [3].

HPV са задължителни интраепителни вируси, присъстващи в кожата, лигавицата и гениталните области [4]. Те се репликират в повърхностните слоеве на лигавицата и епидермис където клетките са по-диференцирани [5]. Клинично HPV се класифицират като лигавични видове и кожни типове. Типовете лигавици са тези, които са най-вече замесени в цервикална неоплазия, а кожните видове в кожни брадавици и други-меланом кожата ракови заболявания.

HPV са от семейство Papillomaviridae, което към днешна дата съдържа 29 рода, образувани от 189 вида папиломавирус. Сто двадесет вида са човешки папиломавируси, а останалите 69 са папиломавируси на животни и птици [6,7]. HPV са кръгови dsDNA вируси с размер приблизително 8 kbs, обикновено съдържащи 8 гена [8]; а именно гените E1 до E7 и гените L1 и L2.

Геномът на HPV се състои от три основни региона, кодиращи ранния регион (E): E1, E2, E4, E5, E6, E7 протеини; и късния регион (L), кодиращ: L1 и L2 протеини; и Дългият контролен регион (LCR), известен също като регулаторен регион нагоре по веригата [9,10]. Регионът L1 е най-консервативният регион на генома на HPV и поддържа целостта си след интегриране на вирусна ДНК в генома на гостоприемника [11-13]. По този начин класификацията, диференциацията и молекулярната диагностика на HPV се основават единствено на вариациите на нуклеотидната последователност в L1 региона на геном.

По-долу е представена селекция от методи за оценка и епидемиологични проучвания, критично прегледани, за да се предостави информация за избора на методи, налични за използване в различни HPV приложения.

Методи за откриване на HPV

HPV не се отглежда успешно в клетъчни култури и прилагането на серологични тестове има ограничена точност поради неспособността му да прави разлика между настоящи и минали инфекции (HPV lab manual, 2009). Откриването на специфични за HPV нуклеинови киселини остава най-добрият метод за откриване на HPV в клинични проби. Налични са няколко молекулярни метода за откриване на HPV, които могат да бъдат категоризирани в техники на амплификация и неамплификация (или тестове за директна хибридизация). Техниките за усилване могат да бъдат допълнително категоризирани като: усилване на сигнала и методи за усилване на целта (HPV lab manual, 2009). Повечето от тези техники обаче са приложени само за HPV на лигавицата. Лабораторното откриване на кожен HPV все още е слабо развито с малкото налични методи, които не обхващат всички кожни генотипове на HPV. Настоящият преглед описва накратко различните молекулярни методи за откриване и генотипиране на HPV с особен акцент върху кожните (бета и гама) видове HPV.

Методи за усилване

Тестовите амплификационни анализи използват полимеразната верижна реакция (PCR) за амплифициране на нуклеинови киселини и са най-широко използваните методи. PCR могат да бъдат направени чрез специфични за типа праймери за амплификация на отделни HPV генотипове или чрез консенсусни праймери, предназначени да амплифицират широк спектър от HPV генотипове [14]. Консенсусните праймери обикновено са предназначени да идентифицират запазени региони на генома на HPV като L1 отворена рамка за четене или E1 област [15,16]. Двойките праймери GP5 +/6 + и MY09/11 са някои от често използваните праймери в HPV консенсусни PCR. Ампликоните, генерирани от PCR, могат да бъдат генотипирани по различни начини, разгледани по-долу.

Полиморфизъм с дължина на рестрикционния фрагмент (RFLP): PCR продуктът може да бъде изследван чрез откриване на полиморфизъм на рестрикционния фрагмент (RFLP), като се използват ензими на рестрикционните ендонуклеази, за да се генерират редица фрагменти, които след това се анализират чрез гел електрофореза [17-19]. RFLP методът е по-малко тромав и по-евтин от секвенирането. Също така може да прави разлика между високорискови и нискорискови HPV, както и да открива множество инфекции.

Блотинг с обратна линия (RLB): Като алтернатива, PCR продуктите могат да бъдат анализирани чрез хибридизация с една или повече специфични за типа олигонуклеотидни сонди, наслоени върху подложка от филтърна хартия или мембранна лента (като петно ​​с обратна линия (RLB), линеен масив и INNO-Lipa) или обвързани по стените на микротитърна ямка [20-22]. Предимството на техниките за хибридизация е тяхната специфичност за откриване на HPV типове, за които сондите са наслоени върху мембранните ленти и следователно, позволява откриване на множество HPV типове в един цикъл.

Последователност на генома на HPV: Друг начин за генотипиране на HPV е чрез директно секвениране на ампликони. След това последователностите ще бъдат сравнени с референтни последователности в базата данни на HPV [23-24]. Напредъкът на техниките за секвениране от секвенцията на Sanger, пиросеквенирането до последното следващо поколение (NGS) или секвенсирането с висока производителност доведе до подобрена скорост, количествено определяне, специфичност и чувствителност. Цената на NGS технологиите обаче все още е висока и не е осъществима за настройки с лоши ресурси.

PCR в реално време: Прилагането на PCR в реално време, което едновременно идентифицира и количествено определя (чрез способността си да определя вирусно натоварване) специфични типове HPV е изключително бързо и възпроизводимо [25-27]. Другото предимство на PCR в реално време е способността му да мултиплексира различни цели на нуклеинова киселина.

Микрочипове и ДНК чипове: Микрочиповете включват хибридизация на PCR продукт върху чип и хибридизираният сигнал се отчита на скенер за ДНК чипове. Основното предимство е способността му да анализира едновременно множество проби.

Анализи за усилване на сигнала, най-широко използваният метод за усилване на сигнала е, а именно, анализът за хибридно улавяне Digene 2 (HC2) и това е единственият одобрен от FDA диагностичен тест за HPV. Този метод се основава на хибридизация на прицелна HPV-ДНК към маркирани РНК сонди и последващо прикрепване/улавяне на хибридите върху ямки с микро титър, след това, откриване чрез система антитяло-субстрат [28-31]. Тестът обаче не го прави генотип, но групира HPV като нискорискови или високорискови видове; и поради тази причина той има широко приложение в епидемиологичните изследвания. Недостатъкът е, че HC2 не е генотип. Генотипирането на HPV е от съществено значение при идентифицирането на единични онкогенни типове, ако трябва да се направят значителни клинични интервенции.

Методи без усилване

Неамплифициращите методи са едни от първите, използвани за диагностика на HPV преди появата на PCR. Те включват южно блотиране, in situ хибридизация (ISH) и хибридизация на точки. Всички те се основават на специфично свързване на сондите с пречистена, но неамплифицирана ДНК върху гел (ютен блотинг) или върху оригиналната проба, ISH [32-35]. Преди това методът на дот-блот се предлагаше като търговски комплект, но вече не се използва, а именно комплектите Virapap и Viratype (Digene Corporation, Gaithersburg, USA). ISH все още се предлага под формата на търговски комплект Kreatech (Kreatech Biotechnology B.V, Амстердам, Холандия) и се използва за изследователски цели. Като цяло недостатъкът на техниките за неамплификация е тяхната ниска чувствителност, което означава, че за откриване са необходими големи количества ДНК и използваната ДНК трябва да бъде непокътната. Тези техники също са тромави и отнемат много време.

Кожни специфични методи за HPV

Ролята на HPV в цервикалната канцерогенеза е твърдо установена. Следователно диагностичните методи спешно стават наложителни [36]. Доказателства в подкрепа на връзката на HPV и кожата лезии са установени сравнително наскоро [37-39]. В резултат на това се наблюдава изоставане в диагностичните техники за кожни HPV.

Според скорошната класификация кожните HPV принадлежат към бета- и гама- папиломен вирус родове [7], докато лигавицата е от алфа рода. Освен това е забелязано, че кожните HPV са филогенетично различни от лигавичните типове [40], от друга страна, кожните HPV заразяват външната кожа. Бета- и гама-папиломавирусите се състоят от HPV, свързани с епидермодисплазията (EV), и филогенетично свързани кожни HPV. Техните генотипове се състоят от HPV типове 4, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 2, 23, 24, 25, 36, 37, 38, 47, 48, 49, 50, 60 и 65.

Преди това бе установена ролята на бета- и гама-HPV в NMSC, но диагнозата беше ограничена от методите за откриване и типизиране. Повечето налични методи разчитат на амплификацията на ДНК чрез консенсусна PCR, последвана от секвениране [41-43]. Образецът за избор при откриване на кожни HPV е кожна биопсия, взета от пациенти, за които се подозира, че имат NMSC. След събиране те се замразяват бързо или се фиксират формалин. HPV ДНК може да бъде извлечена с помощта на няколко търговски метода, следвайки съответните инструкции на производителя.

Методи за PCR на консенсусен праймер и методи за хибридизация

Бета- и гама-кожна PCR (BGC-PCR) [40] се основава на HPV амплификация чрез консенсусни праймери, използвайки смес от шест припокриващи се напред и осем припокриващи се обратни праймери. И двата са насочени към отворена рамка за четене L1, генерирайки 72 bp усилвател и всички обратни праймери са биотинилирани. В този случай усилването е последвано от RLB сонди за множество бета- и гама-HPV типове, които са фиксирани върху найлонова мембранна лента с карбоксилно покритие. Техните PCR продукти се прилагат перпендикулярно на олигонуклеотидните сонди, наслоени в мембраната. След това PCR продуктите се хибридизират с лентата и накрая се подлагат на визуално откриване. Следователно визуалното откриване се постига чрез инкубиране на мембраната в антибиотинов конюгат и откриване на хемилуминесценция. Този анализ открива 25 различни типа HPV и подобрената версия добавя към генотипите на консервирания регион 75, 76, 80, 92, 93, 96 [44]. Този метод има предимството на генотипирането на 25 бета- и гама-HPV типа.

Друг вариант на BGC PCR също е разработен, известен като PM-PCR анализ на обратна хибридизация (RHA) [Diassay, Холандия] [45]. Този метод използва същия принцип, но използва намалено количество праймери с широк спектър, т.е. два напред и седем обратни, насочени към региона E1. В резултат на това вариацията генерира 117 bp усилвател в сравнение с версията със 72 bp от BGC-PCR; промяна на специфичността. Методът на хибридизация е същият, но методът PM PCR RHA има олигопроби за HPV типове 75, 76, 80, 92, 93, 96 (наслоени върху ленти), за разлика от BCG PCR, който идентифицира 4, 48, 50, 60, 65 HPV типа. По този начин PM-PCR е проектиран за бета-папиломавируси, докато BGC-PCR обхваща и двата рода.

Методи за PCR на консенсусен праймер и методи за секвениране

Разработени са няколко PCR метода за кожни HPV, които използват секвениране като метод за генотипиране. Техниката на PCR „висяща капчица“ се основава на PCR вложена процедура с една тръба [46]. Нейната първа PCR реакционна смес с дегенерирани FAP59/64 праймери е насочена към L1 областта на генома на HPV и се поставя в епруветка, където реакцията продължава, докато втората кръгла PCR смес е окачена 25 ul капка върху капака на първа кръгла тръба. След първия кръг същата епруветка се центрофугира и окачената капчица пада обратно в епруветката, което инициира втория кръг PCR. Генерираните ампликони се разделят с електрофореза и след това се клонира, преди да може да се направи секвениране. И накрая, генерираните последователности след това се сравняват със съществуващите последователности в съответната база данни.

Предишен вариант на метода на висящи капчици беше единичен кръг FAP PCR, използващ двойка дегенерирани PCR праймери (FAP59/64) за усилване на широк спектър от кожни типове HPV. Това е последвано от клониране и секвениране за генотипиране [41]. Недостатъците са, че секвенирането не успява да открие случаи на множество инфекции и освен това е много трудоемко. Той има допълнителното изискване PCR продуктите да бъдат клонирани, преди да се извърши директно секвениране, за да се избегне това да дава несъвместими резултати при множество инфекции [41,43].

Мултиплекс PCR и нови методи за генотипиране

Сравнително нова група молекулярни техники позволяват да се открият почти всички 50 вида HPV в бета- и гама-родовете. Един такъв е базиран на Bead мултиплекс генотипиране на 58 HPV от гама, бета, mu и nu родове, замесени в кожни лезии [47]. Този метод се основава на смес от FAP59/64 праймери (т.е. методът на висящи капчици), съчетани с допълнителни 18 праймера, също насочени към L1 региона, чрез вложен PCR метод [41], който също усилва широк спектър от HPV, замесени в кожни лезии. Продукти, маркирани с биотин, PCR, хибридизират до специфични за типа олигонуклеотидни сонди, конюгирани с маркирани с флуоресценция мъниста Luminex и резултатите се четат в анализатор Luminex.

Друг тип мултиплекс PCR метод използва специфични за HPV тип праймери за усилване на регион Е7 с метод за удължаване на масив праймер (APEX) за генотипиране [48]. APEX тестовете се основават на въглерод-6 олигонуклеотиди, етикетиран с флуоресцираща боя, имобилизиран върху предметно стъкло [49]. След това PCR ампликоните се поставят върху чипа и се инкубират, за да се осъществи хибридизация, а откриването се постига чрез измерване на интензивността на флуоресценцията. Прилагането на нови техники за секвениране на ДНК като NGS се опитва да се използва за откриване на HPV [50]. Тези нови технологии позволяват бърза, точна диагностика, откриване на нови типове и варианти на HPV и използване в големи епидемиологични проучвания [51]. Сред тези нови методи на пазара е методът за приосеквениране 454 (който е тестван за използване при генотипиране на HPV) [52], технологиите за йонно протонно секвениране [53] и цяла гама от други NGS технологии; които имат висока производителност.

Дискусия

Избор на методи

Сравнение на кожни HPV методи

маса 1 показва избора на молекулярни методи, налични за кожни типове HPV от бета- и гама-родовете, които са от съществено значение при откриването на типове HPV от всички видове кожни лезии.